Тьюки стал бакалавром (1936) и магистром по химии (1937) в Брауновском университете. Затем поступил в Принстонский университет, где получил степень доктора философии по математике. Во время Второй мировой войны работал в Fire Control Research Office, позже вернулся обратно в университет. Параллельно участвовал в разработках при Bell Labs.
В некоторых источниках Джону Тьюки приписывается авторство терминов «software» (программное обеспечение) и «bit» (сокращение от binary digit).
В 1985 году Тьюки ушёл на пенсию. На 85-ом году жизни после недолгой болезни скончался от сердечного приступа.