Сын декабриста Ивана Дмитриевича и его жены Анастасии Васильевны Якушкиных. Родился в Москве, через полторы недели после ареста отца. Назван Евгением в честь близкого друга отца, декабриста Е. П. Оболенского. Окончил Юридический факультет Московского университета в 1847 году, после чего слушал за границей лекции по юридическим наукам. В 1848 году женился на Елене Густавовне Кнорринг, дочери инженер-генерал-майора Г. И. фон Кнорринга (недоступная ссылка) (Проверено 13 октября 2011). В 1853 и 1855—1856 годах ездил в командировки в Сибирь, где виделся в Ялуторовске, а затем в Иркутске со своим отцом и познакомился со многими декабристами. Служа по Межевому корпусу, Якушкин состоял преподавателем законоведения в Константиновском межевом училище в Москве.
В 1859 году перешёл на службу в Ярославль управляющим палатой государственных имуществ; здесь он принял самое близкое участие, как член губернского присутствия, в проведении крестьянской реформы в Ярославской губернии; когда закончилось устройство быта государственных крестьян, Якушкин перешёл в управляющие ярославской казённой палаты и занимал это место до 1884 года. Так как он был вместе с тем, по должности, членом губернского присутствия по крестьянским делам, то всё выкупное дело в губернии шло через его руки. Сам Е. И. Якушкин освободил своих крестьян полностью, без выкупа и с землёй. В 1860-х годах он был в числе учредителей и учителей воскресной школы в Ярославле, и в числе учредителей общества вспомоществования учащимся и его председателем.
С молодых лет ему были близки литературные интересы. Ещё в 1850-х годах Якушкин начал печатать статьи и заметки в журналах по общественной и литературной истории; большое значение имели статьи его о сочинениях Пушкина в «Библиографических записках» 1858 года, давшие важные дополнения, по подлинникам и по копиям, к тексту Пушкина. Зная лично близко многих декабристов, Якушкин собрал много материалов, касающихся их деятельности, ссылки декабристов и пр. По его инициативе были написаны и напечатаны такие важные мемуары, как воспоминания Басаргина, Пущина, Оболенского, Штейнгеля, Якушкина-старшего и других декабристов. Один из тайных корреспондентов «Полярной звезды», в начале 1860-х годов был близок к обществу «Земля и воля». До преклонных лет находился под наблюдением полиции.
Якушкин близко изучил крестьянское дело и условия крестьянского быта, и это отразилось на направлении его научно-литературной деятельности в область этнографии, в частности — обычного права. Его многолетний труд — библиография обычного права — не только единственный в своём роде, но замечателен и как работа библиографическая вообще. Первый выпуск «Обычного права» вышел в 1875 году, второй — в 1896 году, третий («Обычное право русских инородцев») — в 1899 году, четвёртый (посвящённый крестьянскому землевладению) — в 1909 году. Им составлены также «Материалы для словаря народного языка в Ярославской губернии» (Ярославль, 1896).
Е. И. Якушкин постепенно составил себе обширную библиотеку (около 15 000 томов), в которой было много книг по всем отраслям знания, немало библиографических редкостей, а некоторые отделы были известны своей полнотой. Часть книг из неё Якушкин передал в дар библиотекам Москвы и Ярославля. После его смерти библиотека перешла к его сыну Вячеславу — исследователю русской истории и истории русской литературы. В дальнейшем библиотека поступила в Московский городской народный университет имени А. Л. Шанявского(недоступная ссылка) (Проверено 13 октября 2011).
Умер Е. И. Якушкин в Ярославле. Провинциальный Некрополь Якушкинъ Евгенiй Ивановичъ, р. 20 января 1820 † 27 апр?ля 1908 (С. Марьинское Нерехт. у.).