Родился 7 апреля 1971 года в семье актёров Жерара и Элизабет Депардьё. Родители, посвятив всю жизнь театру и кино, имели мало времени для сына, от чего Гийом в детстве был очень непослушным и плохо учился. За поведение его выгоняли почти из всех школ, в которые его отправляли родители. В подростковом возрасте рано начал употреблять алкоголь и наркотики (гашиш, героин), часто нарушал закон, занимался кражами. Некоторое время находился на учёте в полиции. Несколько раз он приговаривался к тюремным срокам и штрафам.
В 1995 году в туннеле Сен-Клу упавший с двигающегося впереди автомобиля чемодан спровоцировал падение Гийома Депардьё с мотоцикла и сильное повреждение правого колена. В 2003 году, в возрасте 32 лет, после 8 лет непрекращающихся невыносимых болей, несмотря на лечение антибиотиками и морфином, решается на ампутацию правой ноги по колено и использование в дальнейшем протеза, позволившего ему снова ходить.
Был госпитализирован 11 октября 2008 года в Бухаресте, где снимался в фильме «Детство Икара». Продюсер фильма Дан Бурлак сообщил, что посольство Франции сделало всё необходимое для возвращения актёра на родину тем же вечером. Во время съёмок он испытывал боль из-за застарелых диабета и перитонита. Ему также присылали лекарства из Франции.
Умер 13 октября 2008 года в госпитале города Гарш (департамент Верхняя Сена) после заражения вирусом, который повлёк скоротечную пневмонию (тяжёлую форму воспаления лёгких).