Ученик А. М. Бутлерова. По окончании Казанского университета работал (1862—1865) в лабораториях А. В. Г. Кольбе и Ш. А. Вюрца. В 1870 защитил докторскую диссертацию «Новый способ превращения жирных кислот в соответствующие им алкоголи» и был утвержден экстраординарным, а в 1871 — ординарным профессором Казанского университета .
Исследования Зайцева способствовали развитию и укреплению теории Бутлерова. С 1870 Зайцев вёл исследования предельных спиртов, причём разработал общий способ их синтеза восстановлением хлорангидридов жирных кислот амальгамой натрия. В частности, он получил нормальный первичный бутиловый спирт, существование которого было предсказано теорией строения. В 1873 Зайцев синтезировал диэтилкарбинол действием цинка на смесь иодистого этила и муравьино-этилового эфира. Эта работа положила начало исследованиям французских химиков Ф. Барбье, Ф. Гриньяра и др. (см. также Реакция Гриньяра). В 1885 Зайцев предложил новый метод синтеза третичных предельных спиртов действием цинка на смесь алкилгалогенида и кетона. В 1875—1907 Зайцев синтезировал ряд непредельных спиртов. Разработанные Зайцевым и его учениками методы синтеза при помощи галоген-цинкорганических соединений позволили получить большое число предельных и непредельных спиртов и их производных. Совместно с учениками Зайцев синтезировал ряд непредельных углеводородов (бутилен, диаллил и др.). Особенно большое теоретическое значение имеют исследования Зайцева о порядке присоединения элементов галогеноводородов (НХ) к непредельным углеводородам и отщепления НХ от алкилгалогенидов («Правило Зайцева»). Ряд работ Зайцева и его учеников посвящён многоатомным спиртам и окисям, получению непредельных кислот, оксикислот и лактонов — класса органических соединений, открытого Зайцевым в 1873. Зайцев воспитал большую школу химиков (Е. Е. Вагнер, А. Е. Арбузов, С. Н. Реформатский, А. Н. Реформатский, И. И. Канонников и др.).