Родился в 1843 году в семье мелкого дворянина. В 1868 году окончил юридический факультет Петербургского университета с отличием, получив степень кандидата. Был ординарным профессором истории русского права в Варшавском (с 1873 по 1892 год) и экстраординарным профессором истории русского права в Московском (c 1894 по 1911 год) университетах, преподавал также в Московском императорском лицее, читал открытые лекции по археологии и истории. В 1892—1911 являлся директором Московского архива министерства юстиции (МАМЮ, ныне входит в состав РГАДА).
По убеждениям Самоквасов являлся монархистом, был связан с Союзом русского народа, крупной «черносотенной» организацией. Выступал за полную автономию университетов, считая, что только таким образом можно снизить политическую активность студентов и преподавателей, пагубную для науки.
Был женат на Таисии Васильевне Самоквасовой, детей не имел.
Как учёный, Самоквасов интересовался вопросами этногенеза славян, формирования государства и права Древней Руси, возникновения и развития древнерусских городов. Его перу принадлежит ряд крупных трудов по истории русского права.
Стремясь расширить круг используемых источников, он активно занимался археологическими раскопками в разных частях России. К числу самых известных его находок относится курган Чёрная могила в Чернигове. Свою внушительную коллекцию археологических памятников учёный в 1891 году передал Историческому музею.
Самоквасов также занимался методологическими проблемами археологии, вопросами учёта и классификации находок, являлся соавтором первых официальных инструкций по проведению археологических работ, создавал статистические перечни памятников, находящихся на территории России.
Самоквасов большое внимание уделял изучению истории и современного состояния архивного дела в России и за рубежом. В своём масштабном труде «Архивное дело в России» (1902), до сих пор являющимся одним из важнейших исследований на эту тему, он подверг критике российскую архивную систему, отмечая такие её недостатки, как низкий уровень систематизации архивов, отсутствие содержательных описей, малую численность и недостаточную квалифицированность (отсутствие высшего образования) архивных работников, фальсификацию документов и их недоступность для исследователей.
Эти проблемы Самоквасов предлагал ликвидировать с помощью архивной реформы, проект которой был подготовлен им ещё в 1899 году. Она подразумевала образование централизованной системы управления архивами, перевод частных и региональных архивов под государственный контроль, создание специальных высших учебных заведений для подготовки профессиональных архивистов. Многие из этих мероприятий были осуществлены уже после Октябрьской революции.
Будучи руководителем МАМЮ, Самоквасов пытался активизировать работу по систематизации этого крупного архива, описанию содержащихся в нём дел и созданию справочного аппарата. В это время было выпущено 8 томов издания «Описания документов и бумаг МАМЮ», таким образом в научный оборот было введено множество ранее неизвестных источников. Многие из этих описей до сих пор используются в РГАДА. Однако некоторые современники, в свою очередь, критиковали Самоквасова, считая его деятельность бюрократизмом, «для науки совершенно бесполезным».