Джон Салстон окончил Кембриджский университет в 1963 году и там же защитил докторскую диссертацию по химии нуклеотидов в 1966 году. В 1966-1969 годах работал в Институте Салка (Сан-Диего), после чего вернулся в Великобританию, где стал работать под руководством Сиднея Бреннера в лаборатории молекулярной биологии (MRC, Кембридж). Играл ключевую роль в проектах геномов Caenorhabditis elegans и человекa. Доказал, что секвенирование генома Caenorhabditis elegans необходимо, чтобы показать возможность крупномасштабных проектов по секвенированию. Был директором Центра Сангера (сейчас Институт Сангера) в 1992-2000 годах.
Один из наиболее существенных вкладов Салстона — полное описание порядка деления эмбриональных клеток C. elegans. В его лаборатории была прослежена судьба абсолютно всех клеток в процессе развития этого червя. После завершения проекта «Геном человека» Салстон занялся общественной деятельностью, в частности он выступает против патентования генетической информации человека.
В 2002 году Джон Салстон вместе с Робертом Хорвицем и Сиднеем Бреннером получил Нобелевскую премии в области медицины и физиологии «За открытия в области генетического регулирования развития человеческих органов».