Джон Эрнст Уокер родился в Галифаксе и провёл детство в сельской местности. В 1964 году он окончил Колледж Св.Катерины Оксфордского университета, а в 1969 году в этом же университете сделал диссертацию по пептидным антибиотикам. После этого Уокер работал за границей: в США в Университете Висконсин-Медисон (1969—1971) и во Франции в Жив-сюр-Иветт и в Институте Пастера (1971—1974). Затем Джон Уокер вернулся в Англию, где начал работать в лаборатории молекулярной биологии Медицинского исследовательского совета, одного из важнейших исследовательских центров Великобритании. В 1978 году он стал исследовать митохондриальные мембранные белки (по сути это была АТФ-синтаза). Уокер раскрыл ферментативный характер синтеза АТФ в клетке.
В 1997 году Уокер получил Нобелевскую премию по химии за это открытие вместе с Полом Бойером.