Является одним из создателей учения о дыхании человека, о его регуляции и роли в этом процессе углекислого газа. Ученый исследовал токсическое действие окиси углерода, разработал методы борьбы с отравлением этим газом. Впервые определил состав альвеолярного воздуха у человека с помощью созданного им газоаналитического аппарата (аппарат Холдейна). В 1911 возглавил высокогорную экспедицию на пик Пайкс (шт. Колорадо), положившую начало исследованиям по приспособлению организма к экстремальным условиям. Занимался вопросами охраны труда шахтёров, изучал влияние влажности воздуха на переносимость организмом высоких температур. Исследовал взаимодействие между дыханием и кровообращением, определял минутный объем при мышечной деятельности. Разработал новый метод декомпрессии, создал основы профилактики кессонной болезни. В 1933 участвовал в создании и испытании первого высотного скафандра.
Результаты своей научной деятельности Холдейн обобщил в следующих книгах: