После курса в Геттингенском университете Буркхардт загорелся мыслью отыскать истоки реки Нигер. В 1806 году он направился в Англию с целью заручиться финансовой поддержкой Африканской ассоциации британских джентльменов. Получив одобрение своего проекта, он принялся изучать арабский в Кембридже, а в свободное время изнурял себя пешими переходами и приучался к прочим лишениям.
Настойчивость Буркхардта была вознаграждена весной 1809 года, когда при поддержке Джозефа Банкса он добрался до Сирии, где, выдавая себя за приезжего «шейха», стал изучать в Алеппо законы шариата. Пребывание в Сирии позволило ему в совершенстве овладеть арабским и, не внушая подозрений местным жителям, посетить неизвестные европейцам развалины древних цивилизаций, включая Пальмиру и Петру. Его познания в Коране были настолько обширны, что он написал к нему научный комментарий.
Для самого Буркхардта открытие Петры (благодаря которому он остался в истории) было лишь шагом к заветному переходу через Сахару к истокам Нигера. С целью подготовки этого предприятия он в 1812 г. приехал в Каир, который с той поры стал его домом. Под видом бедного сирийского купца он спустился по Нилу до неведомого тогда Абу-Симбела, затем повернул на восток, переплыл Красное море и едва ли не первым из христиан после Вартемы посетил как Медину, так и Мекку, где прожил три месяца.
Своё описание мусульманских святынь и покушавшихся на них ваххабитов Буркхардт переслал в Европу, где оно было незамедлительно опубликовано и принесло ему известность. Как и прочие записи Буркхардта, оно было составлено по-французски. Весной 1816 года он посетил гору Синай, но вскоре после того подхватил дизентерию и, истощённый длительными путешествиями, умер, не дожив нескольких недель до 33-летия, правоверным мусульманином.