Хепбёрн выросла в Новой Англии в семье врача Томаса Норвала Хепбёрна (1879–1962), работавшего урологом в Хартфордском госпитале, и видной феминистки Кэтрин Марты Хогтон Хепбёрн, возглавлявшей местное отделение суфражистской организации, соратницы Маргарет Сэнгер в борьбе за право на контрацепцию.
С 12 лет Кэтрин Хепбёрн принимала участие в любительских спектаклях, в 1928 году дебютировала в театре в Балтиморе, а год спустя очутилась на бродвейских подмостках. Тогда же она вступила в брак с филадельфийским брокером Огденом Смитом, который продолжался недолго — в 1934 году они развелись. Кэтрин нередко увольняли из театров, но затем приглашали вновь, слишком большой успех спектаклей связывался с её именем и у зрителей, и у критики.
В кино Хёпберн дебютировала в 1932 в фильме «Билль о разводе». Она подписала контракт с «RKO», мастерство актрисы привносило юмор и изящество во всевозможные экранизации второсортных романов и пьес, в которых её занимали, и они даже премировались («Ранняя слава» (1933) — «Оскар»; «Маленькие женщины» (1933) — приз Венецианского кинофестиваля). После провала комедии «Воспитание крошки» (1938), где она снялась с Кэри Грантом и была ядовито названа «отравительницей успеха», Хепбёрн решила порвать с кинематографом и два года отказывалась от всех предложений. Она пыталась получить роль Скарлетт О’Хара в экранизации «Унесённых ветром», но была отвергнута.
Актриса вернулась на сцену, приняла участие в постановке комедии Ф. Барри «Филадельфийская история», вместо гонорара потребовала права на экранизацию спектакля и в 1940 году с триумфом вернулась в кино в главной роли в одноименном фильме, получив за исполнение роли капризной и своевольной богатой аристократки премию нью-йоркских критиков и выдвижение на «Оскар».
В следующей своей работе, «Женщине года» (1942), она встретилась с человеком, с которым её связали в дальнейшем девять картин и двадцатисемилетний роман — Спенсером Трейси. Их взаимоотношениям посвящена книга Гарсона Кэнина «Трейси и Хепбёрн: интимные мемуары» (1972), ставшая бестселлером.
С именем Трейси связан пятилетний перерыв в творческой деятельности Хепбёрн: с 1962 по 1967 год она ухаживала за тяжело больным возлюбленным, сменяя у его постели законную супругу, на которой актёр был женат с 1928 года, но жил отдельно. В 1967 году они снялись в последний раз вместе в ленте Стэнли Крамера «Угадай, кто придёт к обеду?», а после его смерти Хепбёрн вернулась на Бродвей и в кино.
На протяжении всей жизни у Хепбёрн было крепкое здоровье, но к середине 1990-х, после завершения кинокарьеры, оно стало постепенно ухудшаться. Зимой 1996 года она была госпитализирована с пневмонией, которая чуть не убила её. К 1997 году актриса стала очень слаба, довольно мало питалась и почти не разговаривала. В последние годы жизни у Хепбёрн также наблюдались признаки деменции. В мае 2003 года у неё диагностировали активно прогрессирующую опухоль в шее, но из-за преклонного возраста была решено не проводить медицинского вмешательства. Кэтрин Хепбёрн скончалась в возрасте 96 лет 29 июня 2003 года в своём доме в небольшом прибрежном городе Олд-Сейбрук в штате Коннектикут. Актриса была похоронена на семейном участке кладбища Седар-Хилл в Хартфорде.
Смерть Хепбёрн вызвала широкое общественное внимание. В течение нескольких месяцев после её смерти в прессе и на телевидении освещались её жизнь и карьера, ей посвящались многие телепередачи, а заголовки ряда газет и журналов выходили со статьями об актрисе на первой полосе. Президент США Джордж Буш выступил с заявлением, в котором было сказано, что «Хепбёрн войдёт в историю как одно из художественных сокровищ нации». В честь её большого вклада в театральную жизнь страны, вечером 1 июля 2003 года были погашены огни Бродвея. В 2004 году в соответствии с пожеланием актрисы, её вещи были выставлены на аукционе Сотбис в Нью-Йорке, который собрал в итоге 5,8 млн долларов.
С именем актрисы связано несколько мест в квартале Тартл-Бей на Манхэттене, где актриса проживала более шестидесяти лет. В 1997 году городской сад неподалёку от дома где она проживала был назван её именем. Сад состоит из двенадцати ступеней, символизирующие двенадцать номинаций актрисы на премию Американской киноакадемии, каждая из которых содержит надпись с цитатой актрисы. К тому же пересечение Восточной 49-ой улицы и 2-ой авеню названо площадью Кэтрин Хепбёрн. Именем актрисы был назван театр в городе Олд-Сейбрук, где Хепбёрн провела свои последние годы.
Персонаж Кэтрин Хепбёрн появляется в ряде фильмов. В 1977 году актрису сыграла Тола Фелдшью в телефильме «Удивительный Говард Хьюз», а в 1980 году её персонаж в исполнении Мэрианн Тейлор появился в телефильме «Война Скарлетт О’Хара». В 2004 году в биографической драме Мартина Скорсезе «Авиатор» роль Кэтрин Хепбёрн сыграла Кейт Бланшетт, получив за своё исполнении премию «Оскар» в номинации лучшая актриса второго плана.