Отец — инженер-технолог. Мать — профессор Московского филармонического училища Книппер, Анна Ивановна. Старший брат Книппер Константин Леонардович (1866—1924) — инженер-путеец. Младший брат — известный оперный певец Владимир Нардов. Племянники: актриса Ольга Чехова, композитор Лев Книппер
Поначалу она пыталась поступить в студию к А. П. Ленскому (выдающемуся актёру Малого театра), но тот не разглядел таланта молодой ученицы и не принял в свой класс. Однако эта неудача обернулась удачей — она поступила в Музыкально-драматическое училище Московского филармонического общества (1898, класс В. И. Немировича-Данченко), окончив которое, сразу же была принята в только что созданную труппу Московского Художественного театра, став вскоре партнершей Станиславского. Первым спектаклем был «Царь Фёдор Иоаннович» А. К. Толстого, в котором исполнила роль царицы Ирины.
Лауреат Сталинской премии (1943). Награждена двумя орденами Ленина и двумя другими орденами.
Ее крестницей стала сильнейшая советская теннисистка, тележурналист Анна Дмитриева.
Она прожила долгую жизнь. Похоронена на Новодевичьем кладбище в Москве.
В архивах Центрального телевидения сохранилась запись съемки с юбилея Ольги Леонардовны (по всей видимости, 90-летие), где среди прочих выступлений, совместное исполнение, дуэтом, Козловского и Лемешева партии Ленского из «Евгения Онегина»: «Я люблю вас, Ольга», сильно дополненной и перефразированной как поздравление по случаю юбилея.
Первые встречи Ольги Леонардовны с Чеховым проходили на репетициях спектаклей «Чайка» и «Царь Фёдор Иоаннович» (9, 11 и 14 сентября 1898). После этих встреч Чехов писал: «Ирина, по-моему, великолепна. Голос, благородство, задушевность — так хорошо, что даже в горле чешется… лучше всех Ирина. Если бы я остался в Москве, то влюбился бы в эту Ирину». Ольга Леонардовна вспоминала о этих встречах: «…с той встречи начал медленно затягиваться тонкий и сложный узел моей жизни». Чехов не смог увидеть триумф постановки «Чайки» в Художественном театре, но все, кто писал ему в Ялту об этом, замечали о роли Аркадиной — роли, которую исполняла Книппер.
С лета 1899 года между ними началась переписка, продолжавшиеся с перерывами до весны 1904 года. Известно о 443 письмах от Чехова к Книппер и более 400 писем от Книппер к Чехову. Переписка отражает последние годы жизни писателя.
25 мая (7 июня) 1901 года Антон Павлович и Ольга Леонардовна обвенчались. Брак продолжался до смерти Чехова 2 (15) июля 1904 года.
Книппер-Чехова — первая из всех актрис, сумевшая так чётко и ярко передать образ чеховских женщин. Обладая своей неповторимой индивидуальностью и особой, аристократической манерой исполнения, Ольга Леонардовна исполняла ведущие роли во всех основных пьесах Чехова: «Чайка» (1898, Аркадина), «Дядя Ваня» (1899, Елена Андреевна), «Три сестры» (1901, Маша), «Иванов» (1901, Сарра), лирико-комедийный образ Раневской в пьесе «Вишнёвый сад» (1901).
Другими работами Книппер-Чеховой стали: Белина («Мнимый больной» Мольера, 1913), Графиня-внучка («Горе от ума» Грибоедова, 1906), Анна Андреевна («Ревизор» Гоголя, 1908), Майа («Когда мы, мёртвые, пробуждаемся» Ибсена, 1900), Анны Маар («Одинокие» Гауптмана, 1899), Наталья Петровна («Месяц в деревне» Тургенева, 1909).
В советское время сыграла такие роли, как Мамаева («На всякого мудреца довольно простоты»), Мария Александровна («Дядюшкин сон» по Достоевскому, 1929), графиня Чарская («Воскресение» по Л. Н. Толстому, 1930), Полина Бардина («Враги» Горького, 1935).