Отец, Константин Тимофеевич (1824—1910), был священником, автором многочисленных книг по истории церкви, литургике, гомилетике.
В 1883 Н. К. Никольский окончил Санкт-Петербургскую духовную семинарию и поступил в академию, где его научным руководителем был профессор П. Ф. Николаевский. Большое влияние на формирование научных интересов оказал также дед со стороны матери — священник, историк церкви, переводчик Д. С. Вершинский.
В 1887 окончил академию со степенью кандидата богословия (выпускное сочинение было посвящено истории Кирилло-Белозерского монастыря и написано на основании рукописей, хранившихся в академической библиотеке) и стал стипендиатом для подготовки к профессорской должности по кафедре русской истории.
В 1899 получил степень доктора церковной истории за первую часть монографии о Кирилло-Белозерском монастыре.
С 1906 Н. К. Никольский — профессор кафедры русской церковной истории (до этого занимал кафедру гомилетики и истории проповедничества).
Либеральные взгляды Н. К. Никольского стали причиной его увольнения из академии, и с 1909 он преподавал в Санкт-Петербургском университете, где читал курс по истории древнерусской литературы и книжности. 8 октября 1916 был избран академиком. В университете преподавал до 1924, читал лекции также в Психоневрологическом институте и Институте книговедения.
С 1920 по 1925 — директор Библиотеки Академии наук. Был также директором Российской книжной палаты, первым директором Института книговедения.