Главным предметом его изучения была жизнь и деятельность апостола Павла.
Родился 6 (18) декабря 1863 года в селе Кичменгский Городок Вологодской губернии в семье священника. На третьем году жизни, после смерти родителя, взят на попечение старшей сестрой Анной. Начальное образование получил в Кобыльской (село Кобыльско-Ильинское) церковноприходской школе и духовном училище Никольска.
По окончании Вологодской духовной семинарии в 1884 году поступил в Московскую Духовную Академию, которую окончил в 1889 году. Магистерская диссертация — «Блаженный Феодорит, епископ Киррский: его жизнь и литературная деятельность» — получила восторженные отзывы.
По окончании Академии в 1890 году был назначен преподавателем Священного Писания в Воронежскую духовную семинарию. В 1891 был приглашён в Санкт-Петербургскую Духовную Академию на кафедру Священного Писания Нового Завета, которую занимал более двадцати пяти лет.
В 1894 году стал экстраординарным профессором.
По смерти профессора Лопухина в 1904 году, с 14 октября 1904 года вплоть до 1911 года состоял редактором и цензором «Православной богословской энциклопедии» (1900—1911).
В 1905 году был избран членом епархиальной Комиссии по подготовке к Всероссийскому Поместному Собору Российской Церкви, а затем был привлечен к работе Комиссии по выработке нового устава духовных академий. В 1907—1908 годах работал в особых Совещаниях по вопросу о реформе Духовных школ и органов церковного управления. В 1907 выпустил книгу «По вопросам духовной школы средней и высшей и об учебном комитете при Святейшем Синоде».
5 декабря 1909 года был избран членом-корреспондентом Санкт-Петербургской академии наук по отделению русского языка и словесности.
С 1911 года — постоянный член Училищного Совета при Святейшем Синоде.
По поручению Святейшего Синода занимался исправлением перевода книг Нового Завета на русский язык, был редактором в журналах «Церковный вестник» и «Христианское чтение», сотрудником «Православной Богословской энциклопедии»; по смерти А.П. Лопухина стал её редактором. Ряд статей в Энциклопедии были написаны им самим.
В 1914 году Святейший Синод поручил ему редактирование «Справочного и объяснительного словаря к Новому Завету» П.А. Гильтебрандта.
В 1918 году читал лекции в Швеции в Стокгольмском университете.
В 1919 году работал в новообразованный Петроградский Богословский институт и с 1919 по 1921 год исполнял должность архивиста, архивариуса и редактора в бывшем Синодальном архиве.
27 ноября 1920 женился на Анастасии Васильевне Нечаевой, вдове профессора А.П. Лебедева.
В 1921 вместе с женой выехал в Финляндию, оттуда в Германию, затем в Чехословакию, в Прагу, где занял должность профессора в университете.
В 1922—1923 читал курс богословия в Белградском университете; затем принял предложение занять кафедру Священного Писания Нового Завета в Софийском университете.
Был избран членом-корреспондентом Болгарской Академии наук, почётным членом Библейского общества в Лондоне.
Скончался 18 марта 1937 года от болезни почек. Чин отпевания в кафедральном соборе Святой Недели 20 марта совершил митрополит Софийский Стефан Шиков (в схизме; впоследствии Экзарх), который в надгробной речи «назвал Николая Никаноровича Глубоковского величайшим авторитетом в библейской экзегетике православной богословской науки, любящим и верным сыном Церкви, могучим столпом Православия».
Издал около сорока крупных работ и множество статей. Многие его труды остались неизданными: например, обзор «Русское богословие» и некоторые другие.
«Библейский словарь», над которым богослов трудился с перерывами всю жизнь и считавшийся в России утраченным, был впервые издан в 2007 году к 70-летию со дня его кончины.
Его супруга передала его личную библиотеку Синоду Болгарской Церкви; книги погибли во время второй мировой войны в огне вместе с большей частью прочих книг синодальной библиотеки.