Сын проповедника в Хемнице, учился в Лейпциге, где занимался изучением международного права, которое тогда применялось во взаимоотношениях императорской власти и территориальных государей и последних между собой. Позже, в Йене, Пуфендорф изучал ещё математику у профессора Вейгеля; математические познания, равно как и основательно изученная Пуфендорфом философия Декарта оказали в дальнейшем большое влияние на становление его собственного научного метода.
Пуфендорф осознанно сторонился научных степеней и поступил гувернёром к сыну шведского посланника при датском дворе, Койэта. Вместе со всей семьей посланника Пуфендорф был взят в плен; во время восьмимесячного плена, Пуфендорф, не имевший при себе книг, занялся воссозданием в памяти прочитанных им трактатов Гуго Гроция и Гоббса и составил на их основе краткое систематическое изложение основ юриспруденции. Таким образом появились «Elementorum Jurisprudentiae Universalis Libri duo» (Гаага, 1660 г.), где из ряда аксиом и определений выведено всё остальное содержание юриспруденции.
Курфюрст Пфальца, которому было посвящено это сочинение, пригласил Пуфендорфа занять первую в Германии кафедру «естественного и международного права». Кроме этого Пуфендорф читал специальные лекции сыну курфюрста. В Гейдельберге Пуфендорф оставался до 1670 г. и издал в это время под псевдонимом Северина де-Монзамбано знаменитый памфлет на конституцию Священной Римской империи: «De statu Imperii Germanici Liber unus» (Женева, 1667). Этот памфлет переиздавался несколько раз на латинском языке и был переведён на немецкий, французский, английский и русский языки. В некоторых германских государствах книга Пуфендорфа была запрещена; многие выдающиеся учёные написали возражения на неё.
В 1670 г. шведский король Карл XI пригласил Пуфендорфа в основанный им университет в Лунде на кафедру международного права. Слава Пуфендорфа распространилась в Европе отчасти благодаря успеху его лекций, отчасти благодаря новым изданиям его сочинений. Через несколько лет король шведский пригласил Пуфендорфа в Стокгольм и назначил его своим историографом и одним из советников.
В Швеции Пуфендорф издал большую часть своих сочинений, лидирующее место среди которых занимает «De Jure Naturae et Gentium» (Лунд, 1672; Франкфурт, 1684; вскоре после смерти Пуфендорфа переведено на французский, немецкий и английский языки). Один из коллег Пуфендорфа, Бекман, написал на эту книгу критику, в которой выставлял Пуфендорфа вероотступником; но критика Бекмана в Швеции была запрещена, а сам Бекман отправился в изгнание.
В ответ на более поздние нападки Бекмана Пуфендорф напечатал в 1678 г. «Апологию», «Discussio calumniarum» и ещё два иронических послания в стиле «Писем темных людей». Далее Пуфендорфом написаны:
Все эти сочинения были вскоре переведены на французский, английский, голландский языки. В последнем из них Пуфендорф говорит, что в делах религиозных правители имеют право наказывать за богохульство, атеизм, сношение с демонами, сектантство, если оно учит противиться властям, но не должны облагать наказаниями тех, кто допускает отступления от обрядности и придерживается необычных взглядов в научных вопросах.
В 1688 г. Пуфендорф переселился в Берлин, где получил звание историографа. Здесь Пуфендорф написал изданные после его смерти историю Великого курфюрста («De rebus gestis Frederici-Wilh e lmi Magni», Берлин, 1695) и историю короля Швеции Карла Густава. В 1694 г. Пуфендорф получил шведское баронство. После смерти Пуфендорфа были изданы многие из его сочинений, в частности, интересное рассуждение о разногласиях среди протестантами: «Jus feciale divinum» (Любек, 1695).
Свидетельством огромного авторитета Пуфендорфа при жизни и в ближайшее время после смерти являются многочисленные переводы и переиздания его сочинений. В России переводами Пуфендорфа занимался епископ Гавриил (Бужинский), переведший «Введение в историю европейскую» (с лат., СПб., 1718) и «О должностях человека и гражданина» (СПб., 1724). Эти переводы были выполнены под личным наблюдением Петра Великого. Главная заслуга Пуфендорфа — выделение естественного права от богословской схоластики и вывод его на уровень самостоятельной науки. По его мнению, право должно согласоваться лишь с законами разума, независимо от догматов вероисповедания и от существующих законоположений. По предмету отношений церкви к государству Пуфендорф создал теорию так называемого «коллегиализма».
Монтескье назвал Пуфендорфа «Тацитом Германии».