Джефферсон был главой комитета по созданию декларации независимости. Помимо него, в комитете было ещё 4 человека: Джон Адамс, Бенджамин Франклин, Роджер Шерман и Роберт Р. Ливингстон. На одной из встреч комитета, эти 4 человека единогласно попросили Джефферсона написать декларацию самому. Библиотека конгресса США была создана на основе его коллекции. Джефферсон основал Университет Виргинии (University of Virginia) и создал его первую программу.
Джефферсон был губернатором Виргинии (1779—1781), первым государственным секретарем США (1789—1795), вторым вице-президентом (1797—1801) и третьим президентом США (1801—1809). Джефферсон и Мартин Ван Бюрен — единственные американские политики, занимавшие поочерёдно посты государственного секретаря, вице-президента и президента.
Был разносторонним учёным — агрономом, архитектором (спроектировал свою усадьбу Монтичелло), археологом, палеонтологом, изобретателем, коллекционером, писателем.
Он широко известен как один из основных создателей доктрины отделения церкви от государства.
Томас Джефферсон родился 13 апреля 1743 года в штате Виргиния третьим из восьми детей в семье, близкой к самым известным людям штата. Его отец, Питер Джефферсон, валлийского происхождения, занимался плантаторством и геодезией плантаций в графстве Альбермейл. Мать Джефферсона, Джейн (урождённая Рэндольф), дочь Ишема Рэндольфа, капитана флота и плантатора, была двоюродной племянницей первого председателя Континентального Конгресса Пейтона Рэндольфа.
После того, как полковник Уильям Рандольф, старый друг Питера Джефферсона, умер в 1745 году, Питер Джефферсон принял опеку над его поместьем Таккахо и малолетним сыном Томасом Менном Рандольфом. В том же году семейство Джефферсонов переехало в Таккахо.
В 1752 году Джефферсон стал обучаться в местной начальной школе у шотландского священника Уильяма Дугласа и начал изучать латинский, древнегреческий и французский языки. В 1757 году умер отец Джефферсона, от которого Томас унаследовал около 5000 акров земли и несколько десятков рабов. Впоследствии на этой земле был построен Монтичелло.
В 1758—1760 годах Джефферсон учился в школе священника Джеймса Мори. Она находилась в Гордонсвилле, в 12 милях (19 км) от Шедвелла, где вырос Джефферсон, поэтому Томас жил в семье Мори. Там он получил классическое образование, изучив основы истории и наук, и в 1760 году поступил в колледж Уильяма и Мэри в Вильямсбурге, закончив его в 1762 году с высшими возможными оценками. Выбрав философское отделение, он учился математике, метафизике и философии у профессора Уильяма Смолла, который впервые познакомил юного и любознательного Джефферсона с трудами британских учёных-эмпиристов, в том числе Исаака Ньютона, Джона Локка и Френсиса Бэкона, которых Джефферсон впоследствии называл «тремя величайшими людьми, когда-либо существовавшими в истории». В то же время Джефферсон выучился свободно говорить по-французски, полюбил читать Тацита и Гомера, а изучение древнегреческого так его захватило, что грамматику языка он всюду носил с собой. Кроме этого, он стал учиться игре на скрипке. Учился Джефферсон очень добросовестно, иногда, по свидетельству очевидцев, занимаясь по пятнадцать часов в день, и живо интересовался всеми предметами. В это же время он состоял в тайной студенческой организации «Клуб плоской шляпы». Джефферсон часто бывал на вечерах в доме губернатора Виргинии Френсиса Фокьера, где он часто играл на скрипке и получил первые познания о винах, которые впоследствии собирал. В 1762 году Джефферсон закончил колледж с максимальными баллами и, изучив право у Джорджа Вита, получил в 1767 году право заниматься адвокатской деятельностью.
В 1772 году Джефферсон женился на 23-летней вдове Марте Вейлс Скелтон, с которой имел шестерых детей: Марту Джефферсон Рэндольф (1772—1836), Джейн Рэндольф (1774—1775), сына, мертворождённого или умершего сразу после рождения (1777), Мери Вейлс (1778—1804), Люси Элизабет (1780—1781) и Элизабет (1782—1785). Марта Джефферсон умерла 6 сентября 1782 года, и Джефферсон больше никогда не женился. Возможно, впрочем, что у Джефферсона были дети от его рабыни-квартеронки Салли Хемингс, но это не доказано с абсолютной точностью.
Продолжая заниматься адвокатской деятельностью, Джефферсон в 1769 году был избран от графства Эльбермарл в Палату представителей Виргинии (англ. Virginia House of Burgesses). После принятия парламентом Великобритании в 1774 году так называемых Невыносимых актов, включавших в себя ограничение самоуправления колоний и монополию на чай, написал много статей и резолюций против них, которые были объединены в книгу Общий обзор прав человека в Британской Америке (англ. A Summary View of the Rights of British America), ставшую первой напечатанной работой Джефферсона. Книга, в частности, утверждала, что колонисты в Америке имеют естественное право на самоуправление и что английский парламент имеет власть только на территории Великобритании, но никак не в её колониях. После созыва Первого континентального конгресса работа Джефферсона стала программой, представленной делегацией Виргинии в Конгрессе, но была признана слишком радикальной. Тем не менее, памфлет заложил теоретические основы для юридического провозглашения независимости и принёс Джефферсону известность как одному из наиболее патриотичных и думающих политиков.
Вскоре после начала Американской войны за независимость в первых числах июня 1775 года Джефферсон был избран во Второй континентальный конгресс, заседавший в Филадельфии. Когда последний в июне 1776 года рассматривал резолюцию о провозглашении независимости, было решено создать комитет по подготовке сопроводительной декларации. Джефферсон был избран его главой, помимо него, в комитете было ещё четыре человека: Джон Адамс, Бенджамин Франклин, Роджер Шерман и Роберт Р. Ливингстон. На одной из встреч комитета остальные члены единогласно попросили Джефферсона написать первоначальный вариант декларации самому, так как Джефферсон был хорошо известен как писатель. Кроме этого, никто из членов комитета не считал это особенно важным. Консультируясь с остальными членами комитета, Джефферсон написал первый вариант декларации, используя как образцы, в частности, написанную Джорджем Мейсоном Декларацию прав человека Виргинии, присланные государственными чиновниками и населением проекты и собственный проект Конституции Виргинии.
После внесения некоторых изменений Комитетом проект был представлен в Конгресс 28 июня 1776 года. 2 июля Конгресс, проголосовав за независимость, стал рассматривать Декларацию. После двухдневных дебатов из Декларации была удалена почти четвёртая часть текста, в том числе критика рабства и работорговли , что особенно возмутило Джефферсона, который был противником рабства, несмотря на то, что сам использовал рабский труд на своих плантациях. Впрочем, получившийся вариант был утверждён Конгрессом 4 июля 1776 года. Сейчас 4 июля — главный праздник США, День Независимости, а преамбула Декларации, принёсшая наибольшую известность Джефферсону, является самым известным текстом о правах человека.
Вернувшись в Виргинию в сентябре 1776 года, Джефферсон был избран в создаваемую Палату делегатов Виргинии, где пытался обновить и реформировать систему законов штата, чтобы привести её в соответствие со стандартами демократического государства. За три года он составил 126 законопроектов, в том числе об отмене права первородства, о свободе вероисповедания и об упорядочении судебной системы. Кроме того, в 1778 году по инициативе Джефферсона был принят закон о запрете ввоза новых рабов в Виргинию. В том же году билль Джефферсона Закон для более широкого распространения знаний привёл к ряду реформ в его родном университете, в частности, к введению первой в Америке избирательной системы обучения. Кроме того, Джефферсон предложил законопроект об отмене смертной казни за все преступления, кроме убийства и государственной измены, однако с перевесом в один голос законопроект был отклонён.
В 1779 году Джефферсон был избран губернатором штата Виргиния. В 1780 году по его инициативе был произведён перенос столицы штата из Уильямсбурга в Ричмонд, расположенный ближе к центру штата. Джефферсон продолжал проводить реформы в Колледже Уильяма и Мэри, по его инициативе был введён первый в стране студенческий кодекс чести. В 1779 году по просьбе Джефферсона колледж пригласил Джорджа Вита, учителя Джефферсона, на должность профессора права, первую среди всех университетов страны. Тем не менее, недовольный темпами реформ, Джефферсон впоследствии стал основателем Университета Виргинии, где высшее образование было впервые полностью отделено от религиозного.
За то время, когда Джефферсон был губернатором Виргинии, она дважды подвергалась атакам британских войск. В июне 1781 года Джефферсон, Патрик Генри и другие руководители штата были захвачены в плен кавалерийской колонной англичан под командованием Банастра Терльтона, и им едва удалось бежать. Впрочем, Джефферсон незамедлительно ушёл в отставку. Общество было недовольно медленным темпом выполнения его предвыборных обещаний, и Томас Джефферсон больше никогда не избирался на какие-либо государственные посты в Виргинии.
В 1785—1789 годах Джефферсон занимал должность посла во Франции, которая активно помогала американским повстанцам, где жил на Елисейских полях и был популярен в свете. Задачей Джефферсона была координация и дальнейшее развитие отношений между двумя странами. По этой причине Джефферсон в 1787 году не мог участвовать в принятии Конституции США, однако в целом поддержал её, несмотря на отсутствие статей, затем вошедших в Билль о правах. Переписка Джефферсона велась через разработчика конституции, друга и соратника Томаса Джеймса Медисона.
Вернувшись из Парижа, Джефферсон стал первым в истории США государственным секретарём в первом кабинете президента Джорджа Вашингтона в 1789—1793 годах. На этом посту у него начались серьёзные противоречия с секретарём казначейства США Александром Гамильтоном по налоговой политике, и особенно по способу погашения военных задолженностей страны. В то время, как Гамильтон считал, что выплаты по долгам должны быть равно распределены по бюджетам каждого штата, Джефферсон поддерживал принцип выплаты каждым штатом своих собственных задолженностей (главным образом потому, что его родной штат Виргиния практически не имел долгов). В дальнейшем конфликт привёл к тому, что Гамильтон и его партия федералистов стали отождествляться Джефферсоном с монархистами и консерваторами, стремящимися подорвать устои республики. Джефферсон неоднократно заявлял, что федерализм равнозначен роялизму. В этих условиях Джефферсон и Джеймс Медисон основали Демократическо-Республиканскую партию, создав по всей стране сеть своих союзников-республиканцев для борьбы с федерализмом.
В 1793 году между Францией, где произошла революция, и Великобританией началась война. Джефферсон решительно поддержал Францию, но согласился с президентом Джорджем Вашингтоном, что США не должны вмешиваться в европейские дела, и препятствовал попыткам посла Франции Эдмона-Шарля Жене втянуть США в войну, апеллируя к Конгрессу и общественному мнению.
В конце 1793 года Джефферсон ушёл в отставку и удалился в Монтичелло, составив Вашингтону и Гамильтону оппозицию. В 1794 году стараниями Гамильтона был подписан Договор Джея, регламентирующий торговлю с Великобританией и приведший к установлению с ней торговых связей. Джеймс Медисон, в свою очередь, раскритиковал этот договор и был поддержан Джефферсоном.
В 1796 году Джефферсон выставил кандидатуру от Демократической-Республиканской партии на президентских выборах, но проиграл федералисту Джону Адамсу. Впрочем, количества голосов выборщиков хватило для того, чтобы Джефферсон занял пост вице-президента. Написав правила проведения парламентских процедур, в дальнейшем обязанностей председателя Сената он избегал.
Когда началась необъявленная Квази-война между США и Францией, правящая Федералистская партия во главе с президентом Адамсом начала интенсивную подготовку к боевым действиям. Была увеличена численность армии и флота, введены новые налоги и приняты законы о нежелательных иностранцах и подстрекательстве, англ. Alien and Sedition Acts, дававшие Президенту право высылать из страны граждан стран, с которыми США находилась в состоянии войны и лиц, опасных для мира и безопасности государства. Джефферсон, посчитав эти законы атакой на свою партию, написал и добился принятия вместе с Мэдисоном резолюций Виргинии и