Дважды Герой Социалистического Труда (1957, 1963), академик АН СССР (1964) и ВАСХНИЛ (1956), заслуженный деятель науки РСФСР (1969), доктор сельскохозяйственных наук (1960), лауреат Ленинской (1959) и Сталинской (1946) премий.
Родился 2 (14) января 1886 года в селе Тарановка ныне Змиёвский район Харьковской области (Украина). Украинец. Окончил местную школу и 6-классное городское училище в городе Змиёв. В 1907 окончил Харьковское земледельческое училище, а в 1908 году — педагогический класс при нём.
В 1908—1918 — преподаватель Кубанской войсковой сельскохозяйственной школы (с 1909 года был помощником управляющего школой). По совместительству работал агрономом в станице Петропавловская (Курганинский район Краснодарского края). Внедрил на Кубани протравку семян пшеницы перед посадкой для их защиты от вредителей.
В 1918—1924 — преподаватель Кубанского сельскохозяйственного техникума. В 1926 году окончил Кубанский сельскохозяйственный институт. В 1926—1930 — заведующий кафедрой генетики, селекции и семеноводства Кубанского сельскохозяйственного института.
В 1912 году организовал при Кубанской сельскохозяйственной школе опытно-селекционное поле «Круглик» (с 1932 года — Всесоюзный научно-исследовательский институт масличных культур). Проводил опыты с подсолнечником, озимой пшеницей, рожью, просом, кукурузой и клещевиной. С 1924 года руководил селекционной станцией масличных культур.
В августе 1930 года был арестован по ложному доносу и осуждён на 10 лет лагерей. В лагере занимался селекцией местных культур. В мае 1934 года досрочно освобождён и назначен директором Центрального опытного поля Карлага (Карагандинского лагеря). Вывел на созданном им опытном поле урожайный сорт ржи и два вида проса («долинские»).
С мая 1936 года — заведующий отделом селекции и семеноводства масличных культур и лабораторией селекции подсолнечника Всесоюзного научно-исследовательского института масличных культур (город Краснодар). Является одним из инициаторов селекции подсолнечника на высокую масличность. Разработал новые высокоэффективные системы селекции улучшающего семеноводства подсолнечника. Создал 34 сорта подсолнечника (Круглик А-14, ВНИИМК 3519, ВНИИМК 6540, ВНИИМК 8883, Передовик, Салют, Смена и другие). Разрабатывал вопросы агротехники и селекции подсолнечника, пшеницы и кукурузы, исследовал проблемы земледелия и растениеводства. Заложил новое направление в селекции подсолнечника на качество масла с использованием межлинейной гибридизации, которое завершилось созданием первого в мире высокоолеинового сорта Первенец. Успешно решил проблему создания заразиховыносливых сортов подсолнечника. Разработал новую систему семеноводства подсолнечника, основанную на ежегодном сортообновлении.
Депутат Верховного Совета РСФСР 3-5-го и 8-го созывов (в 1950—1962 годах и с 1972 года).
Жил в городе Краснодаре. Умер 11 октября 1972 года. Похоронен на Славянском кладбище в Краснодаре.
Дочь Василия Степановича, Галина Васильевна Пустовойт, — доктор сельскохозяйственных наук. В 1972—1988 годах заведовала отделом селекции сортов подсолнечника ВНИИ масличных культур. Впервые в мире получила фертильные гибриды между культурным и дикорастущими видами подсолнечника. Награждена орденами Ленина, Трудового Красного Знамени и «Знак Почёта».
Бронзовый бюст В. С. Пустовойта установлен на территории Всесоюзного научно-исследовательского института масличных культур, носящего его имя. Именем Героя названы улицы в Краснодаре и Армавире (Краснодарский край). Также в честь него назван российский танкер «Академик Пустовойт».
За особые заслуги в развитии сельского хозяйства и достижение высоких показателей по производству продуктов сельского хозяйства Указом Президиума Верховного Совета СССР от 31 октября 1957 года Пустовойту Василию Степановичу присвоено звание Героя Социалистического Труда с вручением ордена Ленина и золотой медали «Серп и Молот».
За выдающиеся заслуги в развитии сельскохозяйственной науки, выведение и внедрение в производство высокомасличных сортов подсолнечника Указом Президиума Верховного Совета СССР от 10 апреля 1963 года Пустовойт Василий Степанович награждён второй золотой медалью «Серп и Молот».
Академик Академии наук СССР (1964) и ВАСХНИЛ (1956), заслуженный деятель науки РСФСР (1969), доктор сельскохозяйственных наук (1960).