Родился 30 июня 1948 в деревне Захарово (по другим сведениям, в деревне Меленки) Гусь-Хрустального района Владимирской области. Впоследствии вспоминал, что был в этой деревне всего два раза в жизни — когда родился, и второй раз, когда навещал своих бабушку и дедушку. Детство до 14 лет провёл в Эстонии в Пярну, где служил его отец, лётчик Пограничных войск. Родным городом Владимир Иванович считает Санкт-Петербург, куда после демобилизации отца переехала его семья. В Ленинграде окончил 366-ю среднюю школу в 1966.
В 1972 году окончил Ленинградский механический институт («Военмех», ныне Балтийский государственный технический университет) по специальности «Производство летательных аппаратов». Фактически специализировался в сфере проектирования и обслуживания баллистических ракет дальнего радиуса действия.
В 1975—1977 годах служил в Вооруженных силах СССР. Обучался в Краснознаменном институте разведки (ныне Академия внешней разведки).
Трудовую деятельность начал младшим научным сотрудником Государственного института прикладной химии. После окончания службы в Советской Армии работал инженером, старшим инженером Управления Государственного комитета Совета Министров СССР по внешнеэкономическим связям, начальником отдела Физико-технического института им. А. Ф. Иоффе АН СССР.
С 1985 по 1991 год — на дипломатической работе (второй, затем первый секретарь Постоянного представительства СССР при ООН).
Далее — председатель совета директоров АОЗТ «Международный центр делового сотрудничества», начальник Северо-Западной окружной инспекции Главного контрольного управления Президента Российской Федерации.
10 ноября 1996 года стал одним из учредителей скандально известного дачного кооператива «Озеро», наряду с Владимиром Путиным, будущим олигархом Юрием Ковальчуком, совладельцем петербургского банка «Россия» Николаем Шамаловым и др.. В период президентства В.Путина все соучредители заняли высокое положение в органах государственной власти и бизнесе.
С октября 2000 года — заместитель министра транспорта Российской Федерации.
С февраля 2002 года — первый заместитель министра путей сообщения.
24 октября 2003 года совет директоров ОАО «Российские железные дороги» единогласно утвердил кандидатуру Владимира Якунина в качестве первого вице-президента компании.
Распоряжением Правительства Российской Федерации от 14 июня 2005 года № 786-р назначен президентом ОАО «Российские железные дороги».
С января 2006 года является научным руководителем и Председателем Попечительского Совета Центра проблемного анализа и государственно-управленческого проектирования при ООН РАН .
В октябре 2007 года за вклад в реализацию мероприятий по реформированию железнодорожного транспорта, разработку стратегии развития российских железных дорог, обеспечение конструктивной социальной политики, эффективное взаимодействие с органами государственной власти Российской Федерации и субъектов Российской Федерации, а также с зарубежными железнодорожными администрациями и международными организациями награждён знаком «Почетный железнодорожник ОАО „Российские железные дороги“».
В 2005 году защитил кандидатскую диссертацию «Механизм разработки геостратегий в современном российском государстве (на примере транспортно-железнодорожной сферы)»; в 2007 году — докторскую диссертацию на тему «Процессы и механизмы формирования государственной политики в современном российском обществе». Доктор политических наук. Научные труды (монографии): «Формирование геостратегий России: транспортная составляющая», 2005; «Политология транспорта: политическое измерение транспортного развития» , 2006; «Формирование государственной политики в современной России: проблемы теории и практики», 2006 и др.
Распоряжением Правительства Российской Федерации от 12 июня 2008 года № 843-р вновь назначен на должность президента ОАО «Российские железные дороги». Распоряжением Правительства Российской Федерации от 10 июня 2011 года № 987-р в третий раз назначен на должность президента ОАО «Российские железные дороги».
Якунин является председателем Попечительского совета Центра национальной славы и Фонда Андрея Первозванного.
Якунин — председатель Попечительского совета благотворительного фонда социальной помощи детям «Расправь крылья!»
В 2010 Якунин в соавторстве с профессорами В.Багдасаряном и С.Сулакшиным выпустил книгу «Западня. Новые технологии борьбы с российской государственностью», изд-во ЭКСМО АЛГОРИТМ, М.,2010., в которой задолго до событий на Болотной площади и проспекте Сахарова (2011-2012) подробно проанализировал новые сетевые технологии разрушения российской государственности, в том числе посредством вербовки деструктивных масс через социальные сети Интернета. Непосредственно о железных дорогах в книге не сказано ни слова, отмечает рецензент Анатолий Салуцкий, что заставляет экспертов предположить, что Якунин участвовал в данном издательском проекте в своём альтернативном амплуа деятеля внешней разведки и контрразведки.
С конца 2010 года является заведующим кафедрой государственной политики факультета политологии МГУ имени М. В. Ломоносова.
С 13 января 2010 года — член попечительского совета фонда «Русский мир»
Якунин — президент мирового общественного форума «Диалог цивилизаций».
22 сентября 2010 года завел блог в Живом Журнале.
Женат. Имеет двух сыновей и троих внуков. Свободно владеет английским языком.
По некоторым данным являлся офицером КГБ СССР и проходил службу в научно-технической разведке — Первом главном управлении КГБ СССР (ПГУ).
Как минимум дважды Якунин в качестве главы ОАО «РЖД» широковещательно делал опрометчивые и преждевременные заявления, которые потом пришлось дезавуировать. Так, в июле 2009 он подписал приказ о переименовании Ленинградского вокзала в Николаевский, своё решение мотивировал девизом «историзм и преемственность», но после разразившегося скандала уже через 4 часа приказ был назван «технической накладкой», отменён и вокзалу возвращено прежнее имя. В ноябре 2011 Якунин неожиданно объявил, что пассажирское движение по Малому кольцу МЖД будет запущено уже в 2012, хотя модернизация и электрификация внутригородской кольцевой магистрали на тот момент ещё даже не начинались, а все проекты рассчитаны на 2-3 года реализации. Вскоре конфуз был улажен и официально подтверждено, что пассажирская линия на МКЖД будет открыта не ранее 2014.
21 декабря 2010 Полиция Безопасности Эстонии КаПо (эст. KaPo) опубликовала на своём сайте значившийся ранее секретным документ No.98T, из которого следовало, что президент Российских железных дорог Владимир Якунин обещал председателю Центристской партии и мэру Таллина Эдгару Сависаару и вице-мэру Таллина Денису Бородичу поддержку партии к парламентским выборам (назначены на 6 марта 2011 года) в размере 1,5 млн евро, за передачу и легализацию денег среди прочих должен был отвечать вице-мэр столицы Денис Бородич.
Документ, в частности, гласит, что Якунин 23-24 июня 2010 года побывал с визитом в Эстонии, куда за день до этого уже приехал руководитель администрации РЖД Владимир Бушуев. 24 июня, во время увеселительной прогулки на катере в Таллинском заливе, Якунин сообщил Бородичу что «запрошенных трёх не будет, можно 1,5». В ходе дальнейшей культурной программы они посетили мызу Килтси в Ляэне-Вирумаа.
На мызе Сависаар, Бородич, Бушуев, Сергей Петров (владелец действующей в Эстонии транзитной фирмы Petromaks Spediitor AS) и Якунин, по предложению последнего, уединились для конспиративной беседы. В ходе беседы Якунин сообщил, что на парламентские выборы Центристская партия получит 1,5 млн евро. Из них 1/3 наличными, 2/3 денежным переводом на основании счетов. Также Якунин напомнил всем, что говорить о сделке нигде не стоит, сославшись на долгий опыт оперативной работы. Ответственными за передачу денег и их легализацию были назначены с одной стороны Сергей Петров и с другой стороны — Бородич.
19 февраля 2011 года на приёме мэра в Таллинской ратуше после воздвижения креста над ласнамяэским храмом Владимир Якунин лично позвонил своему другу дирижёру Мариинского театра Валерию Гергиеву и получил подтверждение, что вариант приезда симфонического оркестра в Таллин 28 февраля вполне возможен. Внеплановый концерт для закрытого круга лиц состоялся 28 февраля в концертном доме Nokia. Перед началом концерта перед публикой выступил мэр Таллина Сависаар. Мэрия Таллина оплатила только аренду зала в размере 5000 евро. Все остальные расходы были покрыты российской стороной. Многие средства массовой информации Эстонии расценили это событие как подтверждение поддержки властями России Центристской партии.