Родился в семье крестьянина Никиты (таким образом, «Никитин» — отчество Афанасия, а не фамилия). Совершил путешествие в 1468—1474 (датировка Л. С. Семёнова, ранее И. И. Срезневским датировалось 1466—1472 годами) по Персии, Индии и Турции; составил описание этого путешествия в книге «Хожение за три моря». Это было первое в русской литературе описание не паломничества, а коммерческой поездки, насыщенное наблюдениями о политическом устройстве, экономике и культуре других стран.
Никитин отправился в путь из Нижнего Новгорода, будучи в свите ширванского посла. Ограбленный астраханскими татарами в устье Волги, Никитин решил не возвращаться восвояси с пустыми руками, поскольку задолжал, и решил пробраться в Индию где надеялся выгодно продать жеребца, и, купив нужных на Руси товаров, возвратиться домой. Неизвестно, откуда он взял средства на последующее путешествие, так как Ширваншах не пожертвовал и двух монет, чтобы помочь пострадавшим от морских разбойников. Никитин пишет: «А я пошёл в Дербент, а из Дербента в Баку». Однако он ошибся в расчёте:
Обманувшись в надеждах относительно торговых выгод, Никитин вдобавок подвергся и большой опасности:
В своей книге Никитин описывает и красоту южной природы, и богатство землевладельцев и вельмож, пышность дворцов их, и бедность сельского населения, и нравы, и облик жителей Индии:
Тяжело стало Никитину на чужой дальней стороне среди 84 вер:
В связи с присутствием в «Хожении» арабско-персидской лексики и мусульманских молитв (в частности, заключительного текста из Корана), обсуждался вопрос о том, не принял ли Афанасий в Индии ислам. Ряд исследователей (например, Г. Ленхофф) считали его «отступником», в то время как Я. С. Лурье полагал, что следует доверять собственным словам Никитина о сохранении им православия; в случае, если бы он был обрезан во время своих скитаний, он едва ли отправился бы домой на Русь, где ему угрожала бы смерть за перемену веры.
Как купец Афанасий Никитин не имел успеха: единственная торговая операция, описанная в «Хожении» — перепродажа жеребца — обошлась ему в убыток (наложил на нём 68 футунов, то есть «остался в накладе»).
Наконец Никитин выбрал путь домой — через Персию и Трапезунд к Чёрному морю и далее в Кафу (Феодосию). До дома он, однако, так и не добрался, а умер в дороге под Смоленском (на территории Великого княжества Литовского) осенью 1474 года. В 1475 году его рукопись оказалась у московского дьяка Василия Момырёва, и текст её был внесён в Летописный свод 1489, продублирован в Софийской II и Львовской летописях. Также сохранились записки Никитина в Троицком сборнике XV века. Текст, вошедший в летопись, подвергнут был сокращению; более полный текст (но сильнее отредактированный составителем) имеется в Троицком сборнике.
В новое время записки были обнаружены Н. М. Карамзиным в архиве Троицко-Сергиевского монастыря в составе Троицкого сборника. Карамзин опубликовал отрывки в 1818 году в примечаниях к VI тому «Истории государства Российского». Полностью сочинение опубликовал П. М. Строев в 1821 году в издании Софийской II летописи.
В 1955 в Калинине (ныне Тверь) был поставлен памятник Никитину (скульпторы С. М. Орлов, А. П. Завалов, архитектор Г. А. Захаров, бронза, гранит).
В 1958 году вышел фильм «Хождение за три моря» (производство киностудии Мосфильм), роль Афанасия Никитина сыграл Олег Стриженов.