В 325 году Афанасий сопровождал епископа Александра в качестве секретаря в чине диакона на I Никейский собор, где активно участвовал в спорах о природе Христа, отстаивая его единосущность — эти споры привели к формулировке Никейского Символа веры, авторство которого в некоторых позднейших источниках ошибочно приписывается Афанасию.
В 326 году после смерти Александра был избран епископом Александрии, продолжил активную борьбу против арианства, однако после вызова из ссылки императором Константином сначала епископа Евсевия Никомедийского, придерживавшегося арианских взглядов, а затем и самого Ария в 330 году, арианство стало поддерживаемым государством направлением христианства Римской империи. Афанасий отказался признать равноправное сосуществование арианской и ортодоксальной ветвей христианства, отказав арианам в принятии в александрийскую церковную общину.
В 335 году Афанасий был осуждён Тирским собором по обвинению в участии в убийстве мелетианского епископа Арсения и сослан в Трир, был возвращён из изгнания после смерти императора Константина в 337 году. Во время ссылки познакомился со святителем Серватием, который стал одним из его защитников в спорах с арианами на Сардикийском соборе.
Повторно изгнан из Александрии в 340 году, после смерти александрийского епископа Григория в 345 году вернулся на александрийскую кафедру. Осуждён Миланским собором 356 года, после чего бежал из Александрии в верхний Египет, где скрывался до смерти императора Констанция в 361 году.
Император Юлиан, преемник Констанция, объявил о свободе вероисповедания, уравняв, в том числе, язычество и любые ветви христианства; Афанасий, воспользовавшийся этим решением, вернулся в Александрию.
В 365 году после смерти Юлиана, к власти пришёл император Валент, издавший эдикт об изгнании епископов, сосланных Констанцием; Афанасий, опасаясь преследования, опять бежал из Александрии, однако через четыре месяца эдикт был отменён и Афанасий вернулся в Александрию, где занимал епископскую кафедру до конца своих дней, после смерти Афанасия кафедру унаследовал его племянник Петр Александрийский.