Дед — крестьянин, отец — сельский священник, благочинный одного из округов уезда.
Александр учился в Черниговском духовном училище и в Черниговской семинарии. В течение последних четырёх лет пребывания в семинарии он был «инспектором» (местное название) одной из ученических квартир, в обязанности которого, по обычаям старых семинарий, лежала экономическая часть, инспекция за поведением учеников и обучением. Этим инспекторством он приобретал средства для собственного содержания.
По окончании полного семинарского курса он предполагал продолжить образование в Московской духовной академии, но начальством семинарии не был допущен к выпускным экзаменам «по причинам, которые теперь не время разъяснять» (как он написал в автобиографии).
В сентябре 1853 года Кистяковский поступил на юридический факультет Киевского университета.
Испытывая нужду, через месяц после поступления он принят был в «квартиру недостаточных студентов»; а на следующий год — «на полное казённокоштное содержание». В сентябре 1856 года Кистяковский был послан в Козелецкое уездное училище учителем истории и географии; в конце того же года был переведён на такую же должность в Киевское дворянское училище. В начале 1857 года он опять был принят в число студентов с назначением ему ежемесячно содержания в размере 11 рублей.
Окончил курс в декабре 1857 года. Осенью 1857 года был в течение трёх месяцев болен, поэтому результаты экзаменов были для него неудовлетворительны: он был выпущен со званием «действительного студента».
Нужда заставила его поступить домашним учителем в дом М. А. Марковича, жившего в селе Восковцах Прилупкого уезда Полтавской губернии. Там он пробыл до конца августа 1858 года, после чего отправился в Санкт-Петербург для поступления на службу.
16 ноября 1858 года Кистяковский поступил на службу в канцелярии межевого департамента Правительствующего сената, 1 декабря был допущен к исправлению должности младшего помощника секретаря, в которой и утверждён 1 апреля 1859 года. В июне 1859 года был перемещён на такую же должность в канцелярию общего собрания первых трёх департаментов и департамента герольдии Правительствующего сената. 16 ноября 1860 года был перемещён старшим помощником столоначальника в департамент Министерства народного просвещения. В связи с преобразованием центрального управления Министерства народного просвещения 1 июля 1863 года был оставлен за штатом.
С самого окончания университетского курса Кистяковский не переставал заниматься наукой. Первый год, по поступлении на службу, он работал сначала от половины 3 до 8, а потом исключительно по вечерам в Публичной Библиотеке. В 1859 и 1860 годы он перевёл на русский язык сочинение Блюнчли Allgemeines Staatsrecht, оставшееся ненапечатанным. В 1860 году он напечатал в «Журнале Министерства юстиции» в четырёх статьях «Очерк английского уголовного судопроизводства по Миттермайеру». Оставаясь постоянным сотрудником этого журнала, он по переходе на службу в департамент Министерства народного просвещения стал печатать свои работы в «Журнале Министерства народного просвещения». С середины 1861 года он поступил помощником редактора одного журнала, прекратившего своё существование в конце 1862 года.
В декабре 1863 года он выдержал кандидатский экзамен, а в сентябре 1864 года защитил диссертацию pro venia legendi «О пресечении обвиняемому способов уклоняться от следствия и суда, по русскому действующему уголовному судопроизводству». По прочтении двух пробных лекций, был, по ходатайству юридического факультета, допущен к чтению лекций в университете св. Владимира по кафедре уголовного права и уголовного судопроизводства в звании приват-доцента. В этом звании он преподавал уголовное право и судопроизводство в течение трёх учебных лет, в 1864—1867 годах.
По выдержании в течение 6 месяцев экзамена в 1865 и 1866 годах и по защите в мае 1867 года диссертации на степень магистра «Исследование о смертной казни», он 12 мая был утверждён в степени магистра уголовного права, а 2 июня того же года — в должности доцента по кафедре уголовного права и судопроизводства.
С 15 августа 1867 года по 23 апреля 1868 года — в командировке в Санкт-Петербурге и Москве, где тогда были открыты преобразованные суды и введён новый порядок уголовного и гражданского судопроизводства по уставам 1864 года.
По защите диссертации «Историко-догматическое исследование по русскому праву о пресечении обвиняемому способов уклоняться от следствия и суда» 20 декабря 1868 года был утверждён в степени доктора уголовного права.
По избранию факультета и Совета был утверждён министром народного просвещения 9 февраля 1869 года экстраординарным, а 16 февраля 1870 года — ординарным профессором по кафедре уголовного права и судопроизводства.
Во время командировки за границу (сентябрь 1871 — апрель 1873) посетил Венский, Гейдельбергский, Берлинский, Неаполитанский и Римский университеты. Наиболее обстоятельно знакомился со способами преподавания и практических занятий в Гейдельберге и Неаполе.
Основной труд Кистяковского — «Элементарный учебник общего уголовного права», выдержавший три издания (1877; 1882, значительно дополненное; 1891).
Иван Фойницкий оценивал этот учебник так:
Магистерская диссертация Кистяковского — «Исследование о смертной казни» (1867, Киев; переиздание 1896, Санкт-Петербург) — не потеряла актуальность и сейчас: она была вновь переиздана (Тула: «Автограф», 2000. — ISBN 5-89201-022-8), на неё ссылаются как в научных трудах, так и в дискуссиях о смертной казни. В этом труде Кистяковский подробно описал историю вопроса и, проанализировав доводы противников и сторонников смертной казни, сделал вывод:
Другой крупный труд Кистяковского по уголовному праву — докторская диссертация «О пресечении обвиняемых способов уклоняться от следствия и суда» (1869). Её значение, по мнению Фойницкого — преимущественно как разработка этого института в истории русского процесса; догматическая часть труда, также ограничивающаяся русским правом, оставляет впечатление незаконченности.
Монография Кистяковского по вопросу о молодых преступниках и учреждениях для их исправления составилась из публичных его лекций в пользу рубежовской колонии; здесь собран и освещён значительный материал, представляемый практикой русских учреждений этого рода.
В разных повременных изданиях, преимущественно в «Журнале Министерства юстиции», «Журнале гражданского и уголовного права», «Журнале Министерства народного просвещения» и «Сборнике государственных знаний», Кистяковский поместил много мелких статей по вопросам уголовного права и судопроизводства.
Оценивая вклад Кистяковского в науку, Фойницкий писал:
Кистяковскому принадлежит одна из самых первых программ для собирания обычаев по уголовному праву, которая, вместе с программой графа Ефименко, принята в основание географическим обществом при выработке общей программы для собирания юридических обычаев.
С 1 октября 1865 по 12 января 1870 года — директор Киевского тюремного комитета, был уволен по прошению. В 1878 году состоял судьёй университетского суда. Способствовал основанию киевского юридического общества и Рубежовской колонии для малолетних преступников.
Кистяковский занимал видное место среди деятелей украинского национального движения 1860—1880-х годов (по выражению того времени, «южнорусских деятелей»), лично знал В. Б. Антоновича, М. П. Драгоманова, П. П. Чубинского. Свои украинские симпатии он проявил, в частности, участием в журнале «Основа» (первый украинский журнал, издававшийся в Санкт-Петербурге в 1861—1862 годах) и изданием обширного сборника «Прав, по которым судится малороссийский народ» (1879).
В течение 1874—1885 годов Кистяковский вёл дневник, обнародовать который позволил не ранее, чем через 80 или 50 лет после своей смерти; «Дневник» был издан в середине 1990-х годов. Являясь сторонником идеи социализма, он писал: «идеи социализма реализуются путём медленного прогресса, не мечом и огнём, а силой мысли, убеждений и нравственности. Сила мысли сильнее силы оружия». Радикальные течения вызывали у него резкое неприятие.
Убежденный сторонник судебной реформы 1864 года, Кистяковский умер с защитой на устах её важнейшего института — присяжных заседателей. По свидетельству профессора В. Б. Антоновича, бывшего при кончине Кистяковского, «за час до смерти, в разговоре с одним из друзей, он с большим вниманием расспрашивал о ходе дел в текущей сессии окружного суда. Услыхав характеристику некоторых дел и отношения к ним присяжных, он в последний раз оживился, привстал на постели и громко произнёс: я всегда утверждал, что институт присяжных есть святое дело в нашем отечестве! Затем он склонил голову на подушку, и голос его начал более и более ослабевать».
Автобиографию Кистяковского, биографический очерк его, составленный графом Науменко, и список его учёных трудов см. в «Киевской Старине», 1895, № 1; эта книга посвящена памяти Кистяковского, по поводу 10-летия со дня смерти. Там же статья И. Я. Фойницкого, «Кистяковский как криминалист», и И. В. Лучицкого, «Труды Кистяковского в области истории и обычного права». См. также статью Фойницкого в «Северном Вестнике» (1895, № 2).