Родился в Эстляндской губернии Российской империи (по другим данным, в Санкт-Петербурге).
Образование получил на медицинском факультете Дерптского университета (1832—1837), который окончил в звании врача.
Два года работал в Австрии и Германии, где специализировался в области зоологии, этнографии, антропологии.
В 1839 был назначен адъюнктом при кафедре зоологии в университете Святого Владимира (Киев).
В 1840 году Миддендорф участвовал в Лапландской экспедиции К. М. Бэра, собирал материалы по орнитологии, малакологии и геологии Лапландии.
В 1842 году Академия наук по рекомендации К. М. Бэра поручила Миддендорфу организовать экспедицию в Северную и Восточную Сибирь. В период подготовки экспедиции Миддендорф составил карту Таймыра, используя работы С. И. Челюскина и X. П. Лаптева.
В период своей экспедиции в Северную Сибирь и на Дальний Восток в 1842—1845 открыл плато Путорана, стал первым исследователем полуострова Таймыр, Северо-Сибирской низменности, Амурско-Зейской равнины, Станового хребта, нижней части бассейна Амура, южного побережья Охотского моря, Удско-Тугурского Приохотья, Шантарских островов. Отчёт Миддендорфа об экспедиции был для своего времени наиболее полным естественно-историческим описанием Сибири.
В числе научных достижений Александра Миддендорфа первое этнографическое описание ряда сибирских народов и первая научная характеристика климата Сибири, определение южной границы распространения многолетней («вечной») мерзлоты, определение зональности растительности, формулировка т. н. «закона Миддендорфа», объясняющего причины извилистости северной границы лесов.
В 1852 году Александр Миддендорф избирается ординарным академиком Петербургской академии наук, а в 1855 году — непременным секретарем академии.
В 1867 году Миддендорф сопровождал в путешествии по России великого князя Алексея Александровича, в 1869 — великого князя Владимира Александровича.
В 1870, сопровождая Алексея Александровича в путешествии по Белому морю и на Новую Землю, произвел важные наблюдения относительно Гольфстрима к востоку от Нордкапа, открыл Нордкапское течение в Баренцевом море.
В 1870 исследовал Барабинскую степь, в 1878 — Ферганскую долину.
Миддендорф принимал деятельное участие в «Трудах Императорского вольного экономического общества» и состоял президентом ВЭО с 1859 по 1860, когда по болезни был вынужден отказаться от этого звания.
Миддендорф был вице-президентом Русского географического общества.
Миддендорф занимался сельским хозяйством, принимал большое участие в устройстве сельскохозяйственных выставок; преимущественно же он интересовался заменой в Прибалтийском крае местного мало молочного скота более выгодной породой. Из многих изученных им практически пород европейского скота Миддендорф остановился на породе голштинской и на скрещивании её с местным скотом.
Министерство государственных имуществ поставило Миддендорфа во главе особой экспедиции (1883), задачей которой было исследовать современное состояние скотоводства в России. Миддендорф на второй год экспедиции тяжко заболел и не мог более продолжать своей полезной деятельности.
Из практической деятельности Миддендорфа в сельском хозяйстве можно указать ещё на то, что он, кроме благоустройства двух своих обширных имений близ Юрьева (совр. Тарту) и Пернова (совр. Пярну), много лет состоял во главе обширного хозяйства в известной Карловке Полтавской губернии, принадлежавшего великой княгине Елене Павловне.
Не менее известен Миддендорф как ипполог, почему ещё в 1850-х гг. ему было поручено ближе познакомить с коневодством как кавалеристов, так и артиллеристов. Он принимал участие в устройстве русских государственных конных заводов. В «Журнале коннозаводства» Миддендорфу принадлежат статьи по коневодству: «По вопросу об определении чистопородности орловской лошади» (1865), «О подборе производителей» (1866) и многие другие. В 1869 он пытался привлечь внимание российского правительства к возможным выгодам от одомашнивания и разведения лосей.
Расстроенное во время сибирской экспедиции здоровье заставило Миддендорфа последние десять лет жизни провести в Эстонии в своем имении Хелленурме (ныне уезд Валгамаа).