Родился 17 марта 1807 года в селе Малахово Романовского уезда Ярославской губернии в семье местного священника, окончил здесь земскую начальную школу. Образование получил в Ярославской духовной семинарии, затем, в 1824 году, поступил в Харьковский университет, в отделение словесных наук, где его старший брат Евграф преподавал историю, но вскоре перешёл на медицинский факультет. Окончив курс с званием лекаря в 1828 году, он, по выдержании экзамена в Императорской Академии наук, в том же году поступил в Профессорский институт при Дерптском университете; здесь он специально занимался физиологией и в 1833 году удостоен степени доктора медицины, после защиты диссертации «О дыхании птиц».
Отправленный в том же году за границу для усовершенствования в физиологии и других, связанных с нею науках, занимался в Берлинском и некоторых других германских университетах, в том числе в лаборатории И. Мюллера. В 1835 году, по возвращении из-за границы, определён преподавателем в Московском университете. Четыре месяца спустя, при введении в действие нового университетского устава, утверждён в звании экстраординарного профессора по кафедре физиологии и общей патологии, а с 1837 года и до кончины своей читал, в звании ординарного профессора, помимо физиологии, сравнительную анатомию и общую патологию. С 1846 года избирался к тому же деканом медицинского факультета Московского университета.
Умер 22 января 1849 года в Москве. Похоронен на Ваганьковском кладбище.
Филомафитский — один из первых представителей экспериментального направления физиологии в России. Резко критиковал умозрительный путь получения знаний, считал, что опираться можно только на опыт. Прибегал к вивисекции животных (лягушка, собака, голубь). Проводил эксперименты с перерезкой блуждающих нервов, изучал рефлекс кашля, химизм и механизм желудочного пищеварения и другие. Широко использовал оптические приборы (впервые в России применил микроскоп для исследования клеток крови). Стремился связать физиологию с практическими задачами медицины.
Не принимал электрическую теории нервного возбуждения, подчёркивал различие между электричеством и «нервным живым началом». Опережая существовавшие взгляды, полагал, что источником тепла в живом организме является «животно-химический процесс», то есть обмен веществ. Говорил о процессах угнетения и задерживания рефлекторных реакций в головном мозге.
Филомафитский — один из немногих врачей-писателей того времени. Капитальнейшим трудом его является «Физиология, изданная для руководства своих слушателей», изданная частью в 1836 году и долгое время признававшийся одним из лучших русских руководств по этому предмету; труд этот остался неоконченным, так как из 4-х отделов, намеченных автором, изданы только 2 первых и половина 3-го. Это первая оригинальная и критическая сводка опытных физиологических знаний. «Физиология…», написана языком несколько тяжёлым, но это объясняется тем, что Филомафитский первый стал обрабатывать эту науку на русском языке, впрочем, некоторые её отделы, как, например, о нервной системе, отличаются прекрасною обработкою. Труд удостоен Демидовской премии Академии наук. Академик К. Бер в рецензии писал: «В первый раз предлагается русской литературе физиология в том виде, до какого она доведена союзом образованных наций… нет сомнения, что книга… окажет важное влияние на высшее развитие врачебного искусства.»
Также внимания заслуживает другой труд Филомафитского: «Трактат о переливании крови (как единственном средстве во многих случаях спасти угасающую жизнь)», в который он внёс немало нового, добытого собственными наблюдениями, в том числе результаты опытов на обескровленных собаках, сделал теоретические обобщения, описал аппаратуру для переливания крови.
Кроме упомянутых капитальных трудов известна ещё его речь «О жизни», в которой автор стремится найти приложение физиологических начал к физическому воспитанию детей.
Совместно с Н. И. Пироговым разработал в 1847 году метод внутривенного наркоза. После смерти Филомафитского появилась в «Военно-медицинском журнале» его статья «Физиологический взгляд на употребление эфиров, хлороформа и бензина для притупления чувствительности».