Первое упоминание об Алексее в относится к 1618 году, когда он получил чин стольника. Его брат Юрий (Вигунд-Иероним) Трубецкой во время Смуты воевал на стороне поляков и ушёл вместе с ними в Польшу, и, возможно, поэтому Алексей Трубецкой находился в немилости у патриарха Филарета, что выразилось в его назначениях на воеводство в отдалённые города. В 1629 году он был назначен воеводой в Тобольске, затем в Астрахань (1633 год). В 1635 году вернулся в Москву, но не получил никакой должности. С 1640 года началась его военная карьера, его поставили во главе войска, стоявшего в Туле. В 1642 году царь назначает князя Алексея Никитича «большим воеводой», командующим армией на южной границе. В пределах линии Одоев — Крапивна — Тула — Венев — Мценск Трубецким были собраны большие силы, началось строительство крепостей и создание Белгородской засечной черты.
После смерти царя Михаила Федоровича (1645 год) стал приближенным боярина Бориса Морозова, и карьера его быстро пошла в гору. В 1646 году он возглавил личный царский полк. В 1646—1662 годах Алексей Трубецкой возглавлял приказы Сибирский и Казанского дворца, а с 1661 года и Приказ Полковых дел.
В качестве дипломата он был участником переговоров с польским и шведским посольствами в 1647 году, а в марте 1654 года встречался с послами Богдана Хмельницкого, где обговаривал условия вхождения Украины в состав России.
В начале русско-польской войны в 1654—1655 годов А.Н. Трубецкой командовал юго-западной армией, которая в кампанию 1654 года взяла крепости Рославль и Мстиславль, а 24 августа нанесла поражение литовской армии под командованием великого гетмана Януша Радзивилла в битве под Шепелевичами.
В начале русско-шведской войны 1656-58 гг. командовал 8-тысячной армией, наносивший вспомогательный удар в юго-восточной Ливонии. В ходе похода были взяты крепости Нейгаузен, Ацель (Говья) и Кастер. Крупнейшим успехом похода и всей войны стало взятие, после четырехмесячной осады Юрьева-Ливонского.
В 1659 году Трубецкой вновь участвовал в военных действиях на Украине против гетмана Выговского, перешедшего на сторону Речи Посполитой. Командовал русскими войсками во время Конотопской битвы. В 1662 году при его участии было подавлен Медный бунт в Москве. За успешные действия Государь наградил Алексея Никитича вотчиной — городом Трубчевском с уездом и титул «державца Трубческого» (1660 год). После этого, формально оставаясь командующим армией, Алексей Никитич не участвовал в военных походах, а находился при дворе.
В 1672 году он стал крёстным отцом царевича Петра Алексеевича, которому подарил своё родовое имение.
Алексей Трубецкой был женат на Екатерине Ивановне Пушкиной (у. 1669), сестре боярина Бориса Ивановича Пушкина.
В период с 1660 года по 1680 год отстраивал после польского присутствия Спасо-Чолнский монастырь под Трубчевском с удивительной по красоте чудотворнной иконой Чолнской Божией Матери. Пожертвовал большую сумму на Столобенский монастырь преподобного Нила (ныне Нилова пустынь на оз. Селигер), так как преподобный Нил подвизался в пещере под соборной горой в Трубчевске на берегу Десны и был притесняем католиками во время польского нашествия.
Умер Алексей Никитич Трубецкой бездетным в 1680 году, приняв монашество под именем инока Афанасия. Похоронен под алтарём Христорождественского собора Спасо-Чолнского монастыря (ныне Брянская область).