Альфонсо был старшим сыном Эрколе II д'Эсте и Рене Французской, дочери короля Франции Людовика XII и Анны Бретонской. Будучи ещё юношей, состоял на службе у французского короля Генриха II и воевал против Габсбургов. Вскоре после того, как вернулся в Феррару и сделался герцогом, папа римский вынудил Альфонсо выслать свою мать обратно во Францию, в связи с её кальвинистским вероисповеданием. В 1583 году заключил союз с императором Священной Римской империи Рудольфом II во время войны Османской Империи с Габсбургами в Венгрии
При правлении Альфонсо II герцогство достигло высшей точки славы. Ко двору д’Эсте были привлечены такие известные в своё время поэты, музыканты и философы, как Торквато Тассо, Баттиста Гуарини, Луццаско Луццаски, Эрколе Боттригари и Чезаре Кремонини.
Альфонсо содержал Кончерто делле Донне — женский вокальный ансамбль, знаменитый своим исполнительским мастерством. Серьёзные средства герцог также потратил на восстановление замка Эстенсе, разрушенного после землетрясения в 1570 году.
Огромные расходы на войны, дипломатию и открытую роскошную жизнь в результате нанесли значительный ущерб казне герцогства, вместе с тем подорвав и экономическое состояние самого народа.
У герцога не было детей, как законных, так и внебрачных.
Со смертью Альфонсо II в 1597 году законная линия династии оборвалась. Император Священной Римской империи, Рудольф II, признал наследником кузина умершего, Чезаре д'Эсте, которому на тот момент было 24 года. Между тем, правопреемственность была подтверждена лишь императором, но никак не папой римским. В 1598 году Феррарское герцогство перестало существовать и стало частью Папской Области. Такое решение принял папа Климент VIII; он признал власть Чезаре нелегитимной и сомнительной.