Амвросий Медиоланский родился около 340 года в городе Тревире (ныне Трир, Германия) в богатой и знатной римской семье. Тревир был в то время резиденцией префектов римской провинции Галлия, некоторые исследователи даже полагают, что отец Амвросия был префектом. Семья будущего епископа приняла христианство в начале IV века. Святая мученица Сотерия, пострадавшая за исповедование христианства при гонениях Диоклетиана была двоюродной сестрой Амвросия.
После смерти отца в 352 году семья Амвросия переселилась в Рим, где он получил превосходное образование. В 370 г. Амвросий закончил обучение. После краткого периода работы адвокатом в префектуре города Сирмий (ныне Сремска Митровица, Сербия) Амвросий получил должность советника префекта Италии Проба, который был христианином и, ценя таланты молодого и способного Амвросия, покровительствовал ему.
В 373 году Амвросий был назначен на должность префекта северной Италии с резиденцией в Медиолане (ныне Милан), который был тогда вторым городом Италии вслед за Римом.
Медиолан во время наместничества Амвросия сотрясали распри между арианами и ортодоксальными христианами. В 374 г. эти распри помешали избранию нового епископа, поскольку каждая сторона хотела видеть на этом месте своего ставленника. В качестве компромисса была предложена кандидатура Амвросия, который пользовался уважением в городе. Амвросий, который даже не был крещён (практика позднего крещения была распространена в то время даже в христианских семьях), пытался отказаться, но после поддержки его кандидатуры императором Валентинианом I, согласился.
30 ноября 374 г. Амвросий был крещён, затем рукоположён в священники и 7 декабря поставлен в епископы, пройдя, таким образом за 7 дней все ступени церковной иерархии.
После избрания он пожертвовал Церкви всё своё огромное богатство и до конца жизни соблюдал обет нестяжательства, ведя скромный и строгий образ жизни.
Одной из главных сфер деятельности епископа была борьба с арианством и язычеством. Строго отстаивая чистоту ортодоксальной веры, он добился на этом поприще значительных успехов.
Императоры Валентиниан I, Грациан и Феодосий I весьма уважали миланского епископа и во многом под его влиянием боролись с язычеством в Империи. После того, как Феодосий жестоко расправился с восставшими фессалоникийцами, Амвросий наложил на него епитимию, отлучил от причастия и предложил публично покаяться. Авторитет епископа был таков, что император вынужден был подчиниться. Согласно Федориту Кирскому в 390 году Феодосий в праздник Рождества Христова, сложив знаки своего императорского достоинства, публично принёс покаяние в храме и был допущен до причастия.
К концу жизни епископ Амвросий пользовался всенародной любовью. Христианские источники сообщают о многочисленных чудесах, совершённых им в этот период. Однажды во Флоренции, пребывая в доме Децента, он воскресил умершего мальчика. Под его руководством в Милане были построены две базилики — Амвросианская и Апостольская (ныне храм св. Назария), а также основан мужской монастырь. Умер св. Амвросий 4 апреля 397 г. в Великую субботу.
Почитание Амвросия как святого началось вскоре после его смерти, о чем свидетельствуют его латинские и греческие жития, написанные в V веке. В Католической церкви память святого Амвросия совершается 7 декабря, в Православной церкви — 7 декабря по юлианскому календарю (то есть 20 декабря по григорианскому).
Святой Амвросий является покровителем Милана.
В 1447—1450 гг на территории близ Милана существовала Амброзианская республика, названная в честь святого.
Превосходное образование Амвросия позволило ему глубоко изучить подлинники произведений восточных Отцов Церкви, усвоить и продолжить их идеи, перекинув, таким образом, мостик от них в латинское богословие.
В догматических вопросах богословские труды Амвросия затрагивают проблемы, актуальные для споров с арианами — богословие Троицы, христологию, учение о таинствах и покаянии. Многие его работы посвящены толкованию книг Священного Писания и комментариям к ним. Важнейшей областью наследия св. Амвросия являются его проповеди. Они, как правило, исполнены страстной веры, обличают грехи, в первую очередь, гордость и разврат. В труде «О таинствах» св. Амвросий собрал свои проповеди для только что крещёных христиан.
Наиболее известные труды св. Амвросия:
Выдающийся латинский богослов св. Августин считал Амвросия Медиоланского своим учителем и наставником.
Перу св. Амвросия приписывается от 12 до 18 поэтико-музыкальных гимнов, дошедших до наших дней. Четыре из них («Aeterne rerum conditor», «Deus creator omnium», «Jam surgit hora tertia», «Veni redemptor gentium») ему приписывал уже Августин. Наиболее известен гимн «Те Deum laudamus» («Тебя, Бога, хвалим»), в отношении которого авторство Св. Амвросия оспаривается.
Амвросий также был автором 42 гекзаметров на подписях к фрескам Амвросианской базилики. Эти стихи дошли до нас, хотя сами фрески не сохранились.
Хорошее музыкальное образование и большие способности позволили св. Амвросию стать реформатором церковного пения. В частности, именно он ввёл в богослужебную практику Запада антифонное пение.
С именем св. Амвросия Медиоланского связано также появление особого, отличающегося от латинского, амвросианского литургического обряда и особой традиции певческого обихода, известного в музыкальной науке как «амвросианское пение» (см. Григорианский хорал). Амвросианский обряд поныне используется в Миланской епархии.
Св. Амвросий изображается с епископской палицей, посохом, бичом в руке (символ победы над арианами и язычниками). Картины с изображением св. Амвросия создавались многими художниками, среди которых — Рубенс и ван Дейк.
В серии «Collection Bud?» издано сочинение «Об обязанностях»: