Дебютировал в январе 1994 года.
В начале карьеры потерпел 3 поражения. 1-е два поражения были от малоизвестных бойцов. В 3-й раз в июне 1996 года Маргарито проиграл контендеру Родни Джонсу.
В июле 2001 года Антонио Маргарито встретился с чемпионом мира WBO в полусреднем весе Даниэль Сантос. Бой был остановлен в 1-м раунде из-за трамвы глаза у Маргарито, полученной в результате столкновения головами. Сантос после этого боя поднялся в 1-й средний вес.
В марте 2002 года Маргарито встретился за вакантный титул чемпиона мира WBO в полусреднем весе с Антонио Диасом. Маргарито выиграл техническим нокаутом в 10-м раунде. В 10-м раунде Маргарито обрушил град ударов в голову противника. В середине 10-го раунда он провёл левой рукой пять апперкотов подряд в челюсть противника, и Диас опустился на канвас. Он поднялся на счёт 8. Сразу после возобновления боя Маргарито бросился добивать противника. Практически все удары — кроссы и крюки — приходились точно в голову. Команде Диаса надоело смотреть на избиение и они выбросили полотенце. Рефери прекратил бой.
С 2002 по 2004 годы Маргарито провел несколько успешных защиты, победив следующих бойцов — Дэнни Переса, Эндрю Льюиса и Херкулеса Кивелоса.
В сентябре 2004 года Маргарито поднялся в 1-й средний вес и встретился во 2-й раз с чемпионом мира WBO в 1-м среднем весе Даниэлем Сантосом. В бою вновь произошло столкновение головами — на этот раз в 6-м раунде. Поединок несколько раз прерывали для оказания помощи мексиканцу. Бой остановили в самом начале 10-го раунда по совету доктора. По раздельному решению судей победил Сантос. После этого Маргарито вернулся в полусредний вес.
С 2005 году он успешно защищал свой титул против Себастьяна Анреаса Лухана и непобежденного Кермита Цинтрона.
В феврале 2006 года Антонио Маргарито вышел на ринг против своего соотечественника Мануэля Гомеса. Оба боксера атаковали, пренебрегая защитой. Ближе к концу 1-го раунда Маргарито прижал претендента в канатам, и провел чистый правый хук в челюсть, после чего обрушил град ударов. Гомес упал на пол и, находясь уже на полу, выплюнул капу. Рефери досчитал до 5 и, видя, что Гомес продолжает безжизненно лежать, остановил бой. Недовольный остановкой боя, Гомес сразу же вскочил. Комментаторы высказали мнение, что Гомес специально выплюнул капу, чтобы получить передышку.
В декабре 2006 года Маргарито победил Джошуа Клотти.
В июле 2007 года Маргарито встретился с непобежденным Полом Уильямсом. Уильямс был активнее, выбросив вдое больше ударов. По итогам 12-ти раундом судьи единогласным решением объявили победителем Уильямса. В прессе мнения насчёт победителя разделились: часть экспертов согласилась в решением официальных судей, другая часть посчитала, что победил Маргарито, а 3-я часть сочла, что бой закончился в ничью.
В ноябре 2007 года Антонио Маргарито встретился с Голденом Джонсоном. В начале 1-го раунда Маргарито провел серию ударов в голову Джонсона, и тот упал. Он встал на счет 9, и рефери продолжил бой. Маргарито бросился добивать противника. Он прижал его к канатам. Джонсон присел, и сразу же поднялся. Рефери приостановил бой, и начал отсчет. После возобновления боя Маргарито вновь набросился на противника. Он безответно выбрасывал удары. Затем он прижал его к канатам и от серии ударов Джонсон рухнул на канвас. На этот раз рефери не стал открывать счет, а сразу остановил бой. Поединок проходил в рамках шоу, организованного телеканалом HBO, главным событием которого был бой Мигель Анхель Котто — Шейн Мосли.
В апреле 2008 Антонио Маргарито во 2-й раз вышел на ринг против чемпиона мира в полусреднем весе по версии IBF Кермита Синтрона. В середине 6-го раунда Маргарито провёл серию ударов в голову, а затем всречным левым хуком попал в печень противника. Синтрон упал на канвас и не смог подняться на счёт 10. Рефери зафиксировал нокаут.
По ходу всего боя преимущество Пакьяо было очевидным, однако филиппинцу так и не удалось отправить своего соперника в нокаут. Более того, в пятом раунде, находясь у канатов, он пропустил жесткий удар по печени, чем испугал своих поклонников. Впрочем, эта атака стала одной из немногочисленных успешных за весь поединок для мексиканца.
Маргарито получил сильное рассечение под глазом, в связи с чем Пакьяо даже просил рефери прекратить бой, однако судья позволил боксерам провести все 12 раундов.
Пакьяо завоевал титул в восьмой для себя весовой категории! Счет судейских записок: 120:108, 118:110, 119:109.
После боя медиками было установлено, что Маргарито получил серьёзную травму, перелом правой дужки глаза, из-за чего ему не давали разрешение на проведение боёв, в том числе и матч реванш с Мигелем Котто.