Барнет родился 5 (18) июня 1902 года в Москве. Дед Бориса Барнета был потомственным печатником, приехал в Россию из Великобритании.
Учился в Московской школе живописи, ваяния и зодчества, одновременно работал бутафором в Первой студии МХТ.
В 1918 году со второго курса училища ушёл добровольцем в Красную Армию. Окончил Главную военную школу физического образования в Москве. Был профессиональным боксёром. Учился в ГТК (мастерская Л. Кулешова). Член ВКП(б) с 1943 года.
Работу в кино начал актёром в 1924 году, затем выступил как режиссёр. В своём первом фильме «Девушка с коробкой» Барнет передал атмосферу НЭПа с помощью лирики, тонкой иронии и эксцентричной буффонады.
Одной из вершин советского кинематографа стала первая звуковая лента, снятая Борисом Барнетом — «Окраина». В этом фильме через судьбы людей провинциального городка показаны последние годы Российской империи. В этом фильме режиссёр использовал новаторские приёмы монтажа и преподнёс тему войны и революции в небольшом городке с совершенно неожиданной стороны. В фильме своеобразно сплетены патетические и лирические начала.
Большинство снятых Борисом Барнетом фильмов сейчас малоизвестны — часть его работ была выдержана в духе соцреализма, часть была запрещена. Его наиболее известный послевоенный фильм — «Подвиг разведчика» (1948), вызвавший бурную реакцию вскоре после выхода, но в дальнейшем оценивавшийся как образец примитивной пропаганды. При этом, однако, фильм пользовался большой популярностью у зрителей. По мнению коллег по жанру «Подвиг разведчика» заложил основу традиции героико-приключенческих фильмов в СССР 1960—1980 годов.
Снятые Барнетом в 1950-х фильмы оцениваются критиками не столь высоко. Они выдержаны в стиле предыдущих десятилетий и потому не имели популярности ни в момент выхода на экран, ни впоследствии.
В последние годы Борис Барнет работал в разных киностудиях, переезжая из города в город. В 1963 году после конфликта с руководством студии «Мосфильм» подал заявление об уходе и затем покончил с собой в рижской гостинице..
В предсмертной записке Барнет писал о старости и усталости и о том что потерял веру в себя, без которой невозможно работать, а, следовательно, жить
Похоронен на Лесном кладбище в Риге.