ДеФорест Келли родился в городе Атланта, штат Джорджия, 20 января 1920 года. Сын Клары Кейси Келли и Эрнеста Келли. Вначале ДеФорест Келли хотел получить профессию доктора. Великая депрессия не позволила его семье оплатить учёбу в медицинской школе.
В школе ДеФорест Келли пел в церковном хоре (в баптистском приходе отца). Он стал исполнять сольные партии и выступать на радио, а также в Театре Парамаунт с оркестром Лью Форбса . Среднюю школу ДеФорест окончил в 16 лет. В 17 лет он приехал в Лонг Бич, штат Калифорния, с целью навестить родного дядю, предполагая остаться на две недели. В итоге он задержался в Калифорнии на год. Там им было принято решение стать актёром, о чём он сообщил родителям, вернувшись в Джорджию. Поняв, что отец не поддерживает эту идею, ДеФорест переехал в Калифорнию навсегда.
В Калифорнии Келли был замечен руководителем местного театра, Роном Хоуком. Хоук работал над дикцией Келли, который говорил с южным акцентом, а затем предложил ДеФоресту роль в пьесе, в которой был режиссёром. Пройдя репетицию, Келли получил роль. С тех пор ДеФорест вечерами играл в театральной труппе Лонг Бич, днём же работал лифтёром и выполнял работы в нефтяной компании.
Позже ДеФорест со своими друзьями из труппы Лонг Бич начали писать сценарии и делать постановки на одной из местных радиостанций. В то время ДеФорест прошел пробы на роль детоубийцы в фильме «Оружие напрокат», но она в итоге была отдана Алану Лэдду.
В 1942 году ДеФорест исполнил роль бродяги в спектакле театральной труппы Лонг Бич «Бедный молодой человек». Его партнершей была Кэролайн Доулинг, с которой его связали близкие отношения. Роман был прерван Второй мировой войной. ДеФорест вступил в Армейский Воздушный Корпус в Нью-Мексико. Кэролайн смогла к нему приезжать. Позже Келли отправился в Калвер-сити, чтобы сниматься в учебном фильме, который снимался по заказу Военно-морского флота. В это время ДеФорест и Кэролайн решили связать себя узами брака. 7 сентября 1945 года Кэролайн Доулинг стала женой ДеФореста.
Агент, проводящий кастинг актёров из студии «Paramount Pictures» заметил Келли в учебном фильме ВМФ. Келли приглашают на пробы и заключают с ним контракт. Келли работал с «Paramount Pictures» около двух с половиной лет. Первым фильмом, в котором ДеФорест сыграл главную роль, был «Ужас в ночи». Затем он снимался в фильме «Разная девушка».
Через два года супруги Келли переезжают в Нью-Йорк, где Кэролайн устраивается на работу в «Уорнер Бразерс». Там Келли сыграл в фильме «Ты здесь». Это привело его к съёмкам в двух других фильмах. Его исполнение роли Айка Клентона в фильме «Последняя перестрелка в округе Коррал», в котором играли также Барт Ланкастер и Кирк Дуглас, стало его первой ролью отрицательного героя и он получает три предложения съёмок в кинофильмах. Также в Нью-Йорке Келли снялся в нескольких эпизодах телесериалов.
После работы в Нью-Йорке Келли возвращается в Калифорнию, для того, чтобы продолжить кинокарьеру. Около девяти лет он играл роли отрицательных персонажей в фильмах-вестернах, в частности, в фильмах «Графство плачущих деревьев» и «Колдун». Он также снимался в телесериалах, а также многочисленных пилотных проектах на телевидении.
Не желая навсегда остаться в памяти публики, как «плохой парень», ДеФорест снимается в фильме «Куда ушла любовь» и принимает участие в пилотном телефильме «333 Монтгомери». Сценарий «333 Монтгомери» был написан бывшим полицейским Джином Родденберри. Через несколько лет ДеФорест появляется в другом пилотном проекте Родденберри под названием «Полицейская история». Этот проект не принес прибыли. Тем не менее, именно после участия в нём ДеФорест Келли получил роль доктора Леонарда МакКоя в телесериале «Звёздный Путь», сделавшую его знаменитым.
После окончания съемок в «Звездном пути» ДеФорест снялся в ещё нескольких фильмах и участвовал в нескольких проектах на телевидении. После чего вышел на заслуженный отдых. ДеФорест ухаживал за своим садом, где выращивал розы, читал мемуары и делал работы по хозяйству. Иногда у Келли были периоды, когда он увлекался живописью и сочинял стихи, некоторые из которых популярны среди его фанатов.
11 июня 1999 года, после долгого лечения в госпитале, ДеФорест Келли скончался. Ему было 79 лет. Келли был кремирован на следующий день. Согласно написанному им завещанию, прах Келли развеяли над морем.