Дэвид Уильям Духовны родился 7 августа 1960 года в Нью-Йорке, США. Его мать, Маргарет, эмигрантка из Шотландии, преподавала в школе для жителей небогатой части Манхеттена. Отец, Амрам Духовны (1927—2003), уроженец Бруклина из семьи еврейских иммигрантов из Украины, публицист и автор нескольких книг. Родители развелись, когда Дэвиду было 11 лет. Брат — Дэниел, сестра — Лори.
Дэвид хорошо учился в школе, поступил в Принстонский университет на факультет педагогики. В молодости Дэвид решил стать писателем и, чтобы оплатить свое обучение в университете, он подрабатывал доставщиком продуктов, сторожем и барменом. Затем поступил в аспирантуру в Йельском университете, где стал магистром английской литературы и готовился защитить диссертацию на степень доктора философии по теме «Магия и технология в современной поэзии и прозе». Увлёкся театром и стал появляться на сцене во внебродвейских постановках.
Первое появление Духовны на телевидении произошло в 1987 году, когда благодаря своей привлекательной внешности Дэвид снялся в рекламе пива L?wenbr?u. Вскоре Дэвид прерывает работу над докторской диссертацией и начинает брать уроки сценического мастерства. После первого опыта на театральных подмостках он почти сразу же попадает в Голливуд. В 1988 году он дебютировал на большом экране, сыграв незначительную эпизодическую роль в фильме Майка Николса «Деловая девушка».
Примерно через год режиссёр Дэвид Линч оценил вкус Духовны к эксцентрике, и пригласил его на роль трансвестита — агента службы по борьбе с наркотиками агента Дени?з Брайсон в трёх эпизодах сериала «Твин Пикс». В этом качестве Духовны необычайно понравился Залману Кингу, который пригласил его сыграть роль идеального покинутого любовника-рассказчика в фильме «Дневники Красной Туфельки», а потом и одноименного эротического сериала. На одном из кинофестивалей работы Дэвида привлекли внимание Рэнди Стоуна, продюсера студии «XX Век Фокс», который и порекомендовал его Крису Картеру, режиссёру «Секретных материалов» на роль Фокса Малдера. При первой встрече актёр не произвел впечатления на Криса. Его внешность показалась Картеру слишком стандартной. Но после первых проб, Крис решил, что камера просто влюблена в актёра. В 1993 Духовны стал сниматься в научно-фантастическом сериале «Секретные материалы» с ведущей ролью агента ФБР Фокса Малдера, сторонника теории заговора, верящего, что его сестру похитили пришельцы. Снимался в паре с Джиллиан Андерсон, исполнившей роль агента ФБР Даны Скалли. Телесериал стал настоящим хитом, принесшим Дэвиду мировую известность. После семи сезонов и пересмотра контракта Духовны покинул сериал в качестве ведущего актёра, продолжая появляться в отдельных эпизодах. В 2002 году он снялся в финальной серии «Секретных материалов». Интересным фактом является то, что Дэвид с лёгкостью находит общий язык со своими партнёрами по съёмкам. Яркий тому пример его тёплые дружеские отношения с Джиллиан Андерсон.
Снимаясь в «Секретных материалах» Дэвид несколько раз появлялся в культовом сатирическом «Шоу Ларри Сандерса», играя самого себя, но с имитацией гомосексуального влечения к Сандерсу. Зрителям наиболее запомнился последний эпизод сериала, где Духовны спародировал знаменитую сцену допроса Шэрон Стоун в фильме «Основной инстинкт».
Певица Бри Шарп написала и исполнила песню «David Duchovny» в 1999. В песне поётся: «Дэвид Духовны, почему ты не хочешь любить меня?», что является как данью уважения к актёру, так и пародией на поклонение знаменитостям в целом; композиция стала хитом.
Духовны озвучил главного героя компьютерной игры «XIII» в 2003, а также Этана Коула из видеоигры «Area 51».
Начиная с 2007 года Дэвид Духовны снимается в популярном комедийно-эротическом телесериале «Блудливая Калифорния» в роли Хэнка Муди (Hank Moody), известного писателя с проблемами в личной жизни. За эту роль Дэвид в 2007 году получил премию «Золотой глобус» в номинации «Лучший актёр сериала (комедии/мюзикла)».
Духовны женился на актрисе Тее Леони 6 мая 1997 года. 24 апреля 1999 года у них родилась дочь Маделейн Вест Духовны. Второй ребёнок, сын, Кид Миллер Духовны родился 15 июня 2002 года. Чета Духовны живёт в Малибу, штат Калифорния. На 11-ом году брака актёры расстались, и Духовны публично признался, что страдает гиперсексуальностью. Вскоре он прошёл курс лечения в частной клинике, после чего, 5 января 2009 года супруги объявили, что решили начать всё сначала. Однако в 2011 году между супругами вновь возникли разногласия, и в июне они начали жить раздельно.