Джеймс Хепберн был сыном Патрика Хепберна, 3-го графа Ботвелла, сподвижника и вероятного любовника королевы Марии де Гиз. Продолжая политику своего отца, скончавшегося в 1556 г., Джеймс сохранял верность Марии де Гиз и поддерживал профранцузскую политику регентши в период протестантской революции 1559—1560 гг. После возвращения в Шотландию молодой королевы Марии Стюарт в 1561 г. граф Ботвелл, однако, вступил в заговор с Арраном против королевы и её советников, но был схвачен и выслан из страны.
Восстание Морея в 1565 г. и попытки королевы Марии расширить социальную опору её правления привели к её примирению с Ботвеллом. В октябре 1565 г. Джеймс Хепберн вернулся в Шотландию и вошёл в круг наиболее приближенных к Марии Стюарт дворян. Ботвелл был назначен шерифом Эдинбурга и Хаддингдона, ему были переданы важнейшие шотландские приграничные крепости и вверена организация системы обороны против Англии. Во время заговора радикальных протестантов, приведшего к убийству Риччо в 1566 г., Ботвелл собрал крупную армию для защиты королевы.
В то же время Мария Стюарт начала испытывать к графу чувства, далёкие от невинности. Мужественный, энергичный, решительный тридцатилетний Ботвелл резко контрастировал со слабовольным супругом королевы лордом Дарнли. По всей видимости уже осенью 1566 г. страсть Марии Стюарт к Ботвеллу стала очевидным фактом. Историк и гуманист Джордж Бьюкенен, современник Марии и Ботвелла, описывает эпизод, когда поздней осенью 1566 г, в бурю, королева, узнавшая о ранении своего любовника, бросила заседания королевского суда и помчалась практически в одиночестве в его замок на английской границе.
Лорд Дарнли, ставший помехой на пути графа Ботвелла к руке Марии Стюарт, был убит 10 февраля 1567 г. при подозрительных обстоятельствах. Народная молва приписала эту смерть заговору королевы и её любовника. Государственный совет пытался привлечь Ботвелла к ответственности, обвинив в убийстве Дарнли, однако графу путём силового нажима удалось добиться снятия обвинений. В конце марта 1567 г. Ботвелл развёлся с женой, а уже 15 мая 1567 г. состоялось бракосочетание королевы Марии Стюарт и графа Ботвелла, получившего к тому времени титул герцога Оркнейского.
Убийство Дарнли и скандальный брак королевы с предполагаемым убийцей вызвал возмущение в стране. Против Марии Стюарт выступили практически все бароны Шотландии. Общественное мнение в стране и за её пределами также было настроено против королевы. 15 июня 1567 г. королевские войска у Карберри столкнулись с армией, собранной восставшими баронами. После нескольких дней переговоров солдаты королевы дезертировали. Убедившись, что Ботвелл в безопасности покинул поле боя, Мария Стюарт сдалась на милость баронов и 24 июля 1567 г. подписала отречение от престола.
Джеймс Хепберн бежал в свои владения на Оркнейские острова. Парламент, собранный после отречения Марии, обвинил Ботвелла в убийстве и измене и конфисковал его земли. Против него были направлены правительственные войска, которые вынудили Ботвелла отступить сначала на Шетлендские острова, а затем бежать в Норвегию. В Норвегии Ботвелл попал в руки родственников одной совращенной им в молодости девушки и был заключён королем Дании и Норвегии в тюрьму. Граф оставался в заключении до самой своей смерти в 1578 г.