Джеймс Марстерс родился 20 августа 1962 года в городе Гринвилль (Калифорния, США). Джеймс вместе с братом и сестрой вырос в калифорнийском городе Модесто. Ещё в детстве учась в четвертом классе решил стать актёром, сыграв роль в школьной постановке Винни Пуха. После этого он вступил в школьную театральную группу и много играл в различных пьесах и мюзиклах. После окончания школы в 1980 году Джеймс два года учился на курсах актёрского мастерства в Тихоокеанской консерватории актёрского мастерства и Американской театральной консерватории.
Любит сам исполнять каскадёрские трюки. Левша. Был женат на Лиан Дэвидсон, развёлся, есть сын Салливан (Sullivan).
Над левой бровью у Джеймса есть шрам, который он получил во время учёбы в Нью-Йорке. На съёмках в сериале «Баффи — истребительница вампиров» гримёр специально выделял этот шрам, как часть образа Спайка.
В 1987 году Марстерс переехал в Чикаго. Первой серьёзной ролью в театре для него стала роль Фердинанда в театре. За исполнение роли Робеспьера в 1989 году Марстерс был номинирован на премию Joseph Jefferson Award.
В 1990 году Марстерс вместе с Лиан Дэвидсон переехал в Сиэтл, где основал собственную труппу и много играл на сцене.
Зарабатывал на жизнь пением под гитару в ночном клубе в Санта-Монике.
В 1997 году Марстерса пригласили на роль Спайка во втором сезоне сериала «Баффи — истребительница вампиров». Поначалу предполагалось, что персонаж Спайка будет участвовать в сериале несколько серий, но зрителям он понравился и начиная с седьмой серии четвёртого сезона (серия «Инициатива» англ. «The Initiative») его персонаж стал постоянным героем сериала. К последним сезонам персонаж Джеймса становится одним из основных в сериале, а после окончания съёмок в 2003 году режиссёр Джосс Уидон пригласил Джеймса продолжать играть Спайка на регулярной основе в спин-оффе «Ангел».
Британский акцент, необходимый для воплощения роли Спайка, Джеймс копировал у своего партнера по съемочной площадке Энтони Стюарта Хэда, коренного британца.
Кроме ролей в «Баффи — истребительница вампиров» и «Ангел» Марстерс снимался в телесериалах «Тысячелетие», «Тайны Смолвилля» играя роль суперзлодея Брейниака, «Без следа», где играл эпизодические роли.
В течение двух лет (с 2003 года до весны 2004 года) был фронтменом рок-группы Ghost of the Robot. Дебютный альбом группы Mad Brilliant вышел 2 февраля 2003 года. Далее последовал выпуск трёх синглов («Valerie», «David Letterman» and «New Man») и концертный тур по Европе.
Последние работы в кино — небольшая роль в экранизации романа ирландской писательницы Сесилии Ахерн «P.S. Я люблю тебя». Одна из последних работ в кино — съёмки в фильме «Драконий жемчуг: Эволюция» — экранизации манги Акиры Ториямы Dragon Ball. Марстерс играет роль злодея лорда Пикколо. Фильм вышел на экраны 8 апреля 2009 года.