Джон Чемберлен родился 16 апреля 1927 Рочестер, Индиана, вырос в Чикаго. После службы в армии США с 1943 по 1946, учился в Художественном институте Чикаго с 1950 по 1952 и в Black Mountain College с 1955 по 1956, где попал под влияние модернистской эстетики поэтов Чарльза Олсона (Charles Olson, 1910-70) и Роберта Крили, с которыми завел длительную дружбу. В его ранних скульптурах из сварного железа чувствовалось сильное влияние абстрактного экспрессионизма, а также скульптуры Дэвида Смита. В 1957 Джон Чемберлен переехал в Нью-Йорк, где создал свои первые работы из частей разбитых машин, такие как «Shortstop» (1957), благодаря которым он сразу стал узнаваем и получил признание. Его работа была включена в выставку «Искусство ассамбляжа» («Art of Assemblage») в Музее современного искусства, Нью-Йорк, в 1961. В 1962 Чемберлен начал выставляться в галерее Лео Кастелли. На протяжении середины 1960-х он продолжал работать в том же ключе, расширяя формальный язык. Эти работы ассоциировались с джанк-артом.
С 1967 Чемберлен начал интересоваться кино и видео, в 1968 занялся своим наиболее амбициозным кинематографическим проектом — «Wide Point». В это же время вернулся к искореженному металлу после короткого увлечения трафаретной печатью и живописью действия, для которой использовал распылитель для покраски автомобилей. С этого момента его материалы включали не только знакомые шасси, но и резину, пластик и оргстекло. Чуть позднее, во время топливного кризиса, часто использовал канистры, например, в таких работах как «Socket and Kiss» (1979). Помимо кино и живописи, Чемберлен создавал и выставлял рисунки и гравюры — Time Goes By, Purple Disappears (1987).
Первая ретроспектива художника состоялась в 1971 в Музее Гуггенхайма в Нью-Йорке, вторая — в 1986 в Музее современного искусства в Лос-Анджелесе. Он живёт и работает в Shelter Island, Нью-Йорк.