Джон Димитри Негропонте родился в Лондоне в семье греческих эмигрантов. После того, как дети окончили школу, семья переехала в США. В 1956 году окончил школу Phillips Exeter. В 1960 году окончил Йельский университет. Владеет английским, испанским, французским и вьетнамским языками.
В 1960—1997 годах — на дипломатической службе. Негропонте был послом в Гондурасе (1981—1985), помощником госсекретаря по делам океанов, окружающей среде и науке (1985—1987), заместителем помощника президента по национальной безопасности (1987—89), послом в Мексике (1989—1993) и послом на Филиппинах (1993—1996). В 1997—2001 годах — исполнительный вице-президент по глобальным рынкам в компании McGraw-Hill.
В 2001 году назначен Джорджем Бушем представителем США в ООН. 17 февраля 2005 года назначен директором национальной разведки, прослужил в этой должности до февраля 2007, когда его сменил Джон Мак-Коннел.
В 1981—1985 годах Негропонте был послом США в Гондурасе. За четыре года его службы военная помощь Гондурасу увеличилась с 4 млн до 77,4 млн долл. в год. Пришедшая к власти администрация Рейгана увеличивала военное присутствие США в стране (в то время как ранее при Джимми Картере было решено не реагировать на свержение в Никарагуа режима Сомосы сандинистами). В связи с этим в США разразился политический скандал «Иран-контрас».
Сенатор Кристофер Додд в своём докладе показал, что Негропонте был в курсе планировавшихся нарушений прав человека со стороны подпольных военных организаций. Из проведённых газетами The Washington Post и New York Times расследований стало ясно, что Негропонте был одним из активных проводников антикоммунистической политики президента Рейгана в регионе и человеком, благодаря которому была установлена тесная связь между спецслужбами США, армией Гондураса и никарагуанскими контрас.
По мнению некоторых экспертов и журналистов, Негропонте, во время своей службы послом в Мексике в 1989—1993 гг., оказывал помощь правительству страны в борьбе с повстанцами-сапатистами в штате Чьяпас.
В 2004—2005 гг. возглавил дипломатическое представительство США в Багдаде, где организовал создание — по образу и подобию стран Латинской Америки — «эскадронов смерти».
Негропонте обвиняется в том, что он совместно с ЦРУ принимал участие в создании «батальона 316», члены которого похищали, подвергали пыткам и убивали оппозиционеров и неугодных США деятелей. В частности, в 1982 году католическая делегация из Сальвадора потребовала выяснить судьбу пропавших в Гондурасе 30 монахинь. Негропонте заявил, что ему ничего неизвестно об этом. Однако в 1996 году Джек Биннс, бывший послом в Гондурасе до Негропонте, в интервью газете The Baltimore Sun сказал, что монахини были в числе людей, похищенных «батальоном 316» и тайной полицией, контролировавшейся посольством США. После пыток они были убиты — выброшены ещё живыми из вертолёта.
Кроме того, при его поддержке были созданы аналогичные подразделения не только в Гондурасе, но и в Гватемале, Сальвадоре. Появившиеся при его активном участии в Центральной Америке «эскадроны смерти» похитили и убили (включая выкраденных с никарагуанской территории и убитых в Гондурасе людей) не менее 75 тысяч человек.
Жена — Диана Негропонте, член финансируемой правительством США организации «Freedom House».