Уроженец штата Айова, Уэйн начинал в немых фильмах своего приятеля Джона Форда. Впоследствии, когда Форд стал одним из ведущих режиссёров Америки, редкий его фильм обходился без участия Уэйна. Для американцев тридцатых годов Уэйн был воплощением мужественности и индивидуализма. Начиная с ковбойской саги «Большая тропа» (1930), особый успех сопутствовал актёру в «боевиках» с драками и погонями, зачастую весьма малобюджетных.
В 1939 году Уэйн исполнил самую яркую свою роль — в масштабном вестерне «Дилижанс», который с успехом был показан и в советских кинотеатрах. Последний крупный проект Уэйна — «Самый меткий» — вышел на экраны США в 1976 году.
Во время Второй мировой войны снимался во многочисленных постановках на военные темы. По окончании войны вместе с сыновьями основал особую студию, которая специализировалась на производстве вестернов. Среди его фильмов тех лет особо выделяется «Форт Аламо» (1960), который он сам же и поставил. Был собственником острова Таборсилло, который в 1997 году приобрёл австрийский издатель Who is who Ральф Хюбнер.
Уэйн всегда был сторонником Демократической партии.