Родился в г. Бромберг в провинции Позен (сейчас г. Быдгощ, Польша) в семье Августа фон Макензена. В 1908 году поступил на военную службу. Первую мировую войну встретил в звании лейтенанта. После ранения в 1915 году, Макензену была поручена штабная работа. После окончания войны остался в рядах армии и к 1934 году получил звание полковника. В 1935 году был назначен начальником штаба 10-го армейского корпуса. В 1937 году стал командующим кавалерийской бригадой. В 1938 году был повышен в звании до генерал-майора. В мае 1939 года генерал Лист назначил Макензена своим начальником штаба.
К началу Второй мировой войны Эберхард фон Макензен занимал должность начальника штаба 14-й армии, которой командовал Лист, и вместе с ней участвовал в нападении на Польшу. После капитуляции Польши был назначен начальником штаба 12-й армии и направлен во Францию. 1 января 1940 года Макензен был повышен до генерал-лейтенанта, а спустя восемь месяцев — до генерала от кавалерии.
24 марта 1944 года в отместку за нападение партизан на колонну войск СС днем ранее, были расстреляны 335 гражданских заложников. Устный приказ о расстреле заложников был отдан Гитлером фельдмаршалу Кессельрингу, главнокомандующему немецкими войсками в Италии. Макензен в то время командовал 14-й армией и, следовательно, был подчинённым Кессельринга. В свою очередь, ему подчинялся военный комендант Рима Курт Мельцер.
Кессельринг приказал начальнику римского отделения гестапо Герберту Капплеру расстрелять по 10 итальянцев за каждого убитого немца. По информации из других источников, такой приказ был отдан Макензеном. В любом случае, Макензен знал о готовящемся расстреле гражданского населения. Мельцер поручил своему подчиненному Эриху Прибке сформировать расстрельную команду и расстрелять заложников.
После капитуляции Германии Макензен попал в плен к союзникам. В 1947 году он предстал перед судом по обвинению в военных преступлениях. 6 мая 1947 года был признан виновным и приговорен к смертной казни. Впоследствии приговор был заменен на тюремное заключение сроком на 21 год. 2 октября 1952 года Эберхард фон Макензен был освобожден. Он умер 19 мая 1969 года в поселке Альт-Мюлендорф вблизи города Норторф в ФРГ.