Старшая дочь великого герцога Тосканского Франческо I и Иоанны Австрийской. Единственной выжившей сестрой Элеоноры была Мария Медичи, впоследствии королева Франции. Элеонора была крестной матерью её сына, будущего короля Людовика XIII.
В 1584 году Элеонора вышла замуж за Винченцо I Гонзага (1562—1612), вскоре ставшего правителем Мантуи и Монферрата. Дети:
Элеонора умерла 9 сентября 1611 года в возрасте 44 лет.