Элеонора родилась в Толедо, она была второй дочерью вице-короля Неаполя, маркиза Виллафранка дона Педро Альвареса де Толедо, сына второго герцога Альбы. Печально известный в истории Нидерландов герцог Альба приходился ей двоюродным братом. В 1539 году в возрасте 17-ти лет она вышла замуж за Козимо I Медичи.
Великому герцогу Козимо I де Медичи, получившему титул герцога незадолго до своей женитьбы на Элеоноре, пришлась очень кстати поддержка могущественного тестя. Голубая кровь Элеоноры, которой так не хватало Медичи, должна была помочь семье стать вровень с другими европейскими правителями. Помимо этого, Элеонора благодаря своему отцу обеспечила Медичи надёжную связь с Испанией, в то время контролировавшей значительную часть Италии, дав тем самым возможность Козимо продемонстрировать свою лояльность и доверие Испании за вывод испанских войск из провинции. За Элеонору также дали огромное приданое.
По началу не признанная народом иностранка быстро завоевала всеобщее доверие. С одной стороны, Элеонора Толедская прославилась как меценат за помощь, оказываемую художникам, с другой стороны, благодаря ревностной испанской католичке во Флоренции появились иезуиты и было построено много храмов. Обладая хорошими организаторскими способностями, она пользовалась доверием и у мужа, который часто оставлял её регентом на время своего отсутствия.
У Элеоноры и Козимо было одиннадцать детей, включая пять сыновей достигших совершеннолетия (Франческо, Джованни, Гарсиа, Фердинандо и Пиетро), до этого династия Медичи была под угрозой угасания из-за отсутствия наследников. Произведя на свет многочисленное потомство, Элеонора обеспечила силу и процветание Тосканы. Её дочери вышли замуж за представителей лучших домов Италии. Два её сына — Франческо и Фердинандо правили как герцоги Тосканы.
Элеонора в возрасте 23-х лет, 1543, Прага
«Портрет Элеоноры Толедской с сыном»