Родился в семье дьякона церкви села Богатырёво. В 1853 женился на сироте, дочери священника. В 1864 овдовел.
Окончил Воронежскую духовную семинарию (1853), Киевскую духовную академию (1869), магистр богословия (1870; тема диссертации: «Нравственное учение святого отца нашего Исаака Сирина»).
С 1854 года — священник. В 1864 был пострижен в монашество своим наставником, воронежским архиепископом Иосифом, который дал ему монашеское имя в честь Иустина Философа, а не Митрофана Воронежского, как хотел Михаил Полянский. Таким образом, владыка Иосиф считал своего ученика будущим христианским мыслителем, а не прочил ему монастырскую жизнь.
В 1864—1865 — народный духовник и проповедник в монастыре, преподаватель Воронежского духовного училища.
В 1869—1870 — преподаватель Харьковской духовной семинарии.
В 1870—1875 — инспектор Литовской духовной семинарии.
С 1872 года — архимандрит.
В 1875—1885 — ректор Костромской духовной семинарии, в которой преподавал догматическое богословие.
С 27 января 1885 — епископ Михайловский, викарий Рязанской епархии.
С 10 августа 1885 — епископ Новомиргородский, викарий Херсонской епархии.
С 16 декабря 1889 — епископ Тобольский и Сибирский.
17 июля 1893 был уволен на покой, назначен управляющим Раненбургской Петропавловской пустынью Рязанской епархии.
С 10 декабря 1894 — епископ Рязанский и Зарайский.
С 14 октября 1896 — епископ Уфимский и Мензелинский.
14 июля 1900 года уволен на покой, был вновь назначен управляющим Раненбургской пустынью.
В июле 1903 года перемещён в Григорьево-Бизюковский монастырь Херсонской епархии, где жил в глубоком затворе в одной из монастырских башен. Там и скончался, и был похоронен.
Во время служения в Тобольской епархии занимался миссионерской деятельностью, внёс значительный вклад в работу Обдорской и других северных епархиальных миссий. Автор догматических, исторических, нравоучительных и гомилетических сочинений, его труды были изданы в 12 больших томах. Митрополит Мануил (Лемешевский) так характеризовал владыку Иустина:
10 февраля 2006 году на историческом здании Воронежской духовной семинарии была открыта мемориальная доска, посвящённая наиболее известным её воспитанникам. На ней увековечено и имя владыки Иустина.