Сын Эглаоса, уроженец Кирены.
Начальное образование Эратосфен получил в Александрии под руководством своего учёного земляка Каллимаха. Другим учителем Эратосфена в Александрии был философ Лизний. Перебравшись затем в Афины, он так тесно сблизился со школой Платона, что обыкновенно называл себя платоником. Результатом изучения наук в этих двух центрах была энциклопедическая эрудиция Эратосфена; кроме сочинений по математическим наукам, он писал ещё трактаты «о добре и зле», о комедии и др. Из всех своих сочинений Эратосфен придавал особенное значение литературным и грамматическим, как это можно заключить из того, что он любил называть себя филологом.
Царь Птолемей III Эвергет после смерти Каллимаха вызвал Эратосфена из Афин и поручил ему заведование Александрийской библиотекой. Удалённый в старости от этой должности, Эратосфен впал в крайнюю нищету и, страдая болезнью глаз или даже совсем ослепнув, уморил себя голодом.
Отголоски призвания обширной учёности Эратосфена звучат и в прозвищах, которые он получил от современников. Называя его «бета», они, по предположению многих исследователей, желали выразить свой взгляд на него, как на второго Платона, или вообще как на учёного, который только потому занимает второе место, что первое должно быть удержано за предками. Другим прозвищем Эратосфена было «пентатл» — пятиборец.
В честь Эратосфена назван кратер на Луне.
Из сочинений Эратосфена по математике до нашего времени дошло только написанное к царю Птолемею письмо об удвоении куба. Это письмо сохранилось в комментарии Евтокия к трактату Архимеда О шаре и цилиндре. В письме содержатся некоторые исторические сведения о делийской задаче, а также описание прибора, изобретённого самим автором и известного под именем мезолябия.
Сведения о других математических сочинениях Эратосфена отличаются крайней неполнотой. Папп в двух местах своего Собрания называет сочинение Эратосфена О средних величинах, замечая при этом, что оно во всех своих предположениях стоит в связи с линейными местами.
О сочинении Эратосфена Платоник, посвящённом пропорциям, говорит Теон Смирнский. Возможно, что именно к Эратосфену восходит алгоритм «разворачивания всех рациональных отношений из отношения равенства», описанный Теоном Смирнским и Никомахом Герасским.
Отрывок из ещё одного сочинения Эратосфена приводит во Введении в арифметику Никомах Герасский. То же делает и Ямвлих в своём комментарии к этому сочинению Никомаха. Предмет этого отрывка состоит в изложении найденного Эратосфеном способа определения произвольного количества последовательных простых чисел (так называемое решето Эратосфена).
Из сочинений Эратосфена по астрономии до нашего времени дошло только одно, Катастеризмы — перечисление созвездий и заключающихся в них звёзд, числом до 700. Определения положений этих звезд сочинение не даёт.
Для своих астрономических наблюдений Эратосфен установил под портиком здания Мусейона большие армиллярные сферы.
Эратосфен определил угловое расстояние от экватора до тропика: он нашёл его равным 11/83 от 180°.
В тесной связи с астрономией находится работа Эратосфена, состоящая в измерении длины земного меридиана. Краткое изложение этой работы известно нам по трактату Клеомеда «О круговращении небесного свода»:
Позднее полученное Эратосфеном число было увеличено до 252000 стадиев. Определить, насколько эти оценки близки к реальности, трудно, поскольку неизвестно, каким именно стадием пользовался Эратосфен. Но если предположить что речь идёт о греческом (178 метров), то его радиус земли равнялся 7,082 км, если египетским, то 6,287 км. Современные измерения дают для усреднённого радиуса Земли величину 6,371 км. Что делает выше описанный расчёт выдающимся достижением и первым достаточно точным расчётом размеров нашей планеты.
В сравнительно больших отрывках дошло до настоящего времени сочинение Эратосфена о географии. В полном своём составе оно делилось, по свидетельству Страбона, на три книги. В первой автор дал критический обзор истории географии, от первого появления географических понятий у Гомера до своих непосредственных предшественников, то есть до историков и географов, воспользовавшихся походами Александра Македонского и их описаниями. Вторая книга излагает основы географии по взглядам самого автора. Предмет третьей книги составляет суша.
Эратосфен является основателем научной хронологии. В своих Хронографиях он пытался установить даты, связанные с историей Эллады, составил список победителей Олимпийских игр.
Сохранились отрывки из сочинения Эратосфена О древней комедии и из двух его поэм; в одной он вкладывает в уста Гермеса рассказ о строении неба, светил и гармонии сфер, в другой передаётся легенда об Эригоне, дочери Икара.