Как утверждает житие святого, Евстратий был богатым жителем города Киева. Раздав всё имущество бедным, он постригся в монахи Киево-Печерского монастыря. Там он за воздержание получил прозвище постника. В 1096 году на Киев, совершили набег половцы и, захватив монастырь, продали Евстратия херсонесскому купцу-иудею вместе с другими пленниками — 30 монастырскими рабочими и 20 другими киевлянами. Как указывают современный киевский исследователь А. Е. Бартош, византийским «евреям запрещалось владеть рабами-христианами, но на практике этот закон часто не выполнялся, особенно в отдалённых провинциях. Херсонесский епарх, будучи сам евреем, принявшим христианство, разрешил евреям покупать христиан и обращать их в рабство. Очевидно, Евстратий, знавший, что существует закон, запрещавший евреям владеть христианами, настраивал своих соотечественников не подчиняться рабовладельцам».
Если верить тексту жития, хозяин пытался заставить их отречься от Христа, однако Евстратий убеждал остальных не поддаваться на уговоры, говоря: «Не будьте, братия, отступниками от веры; через смерть мы получим жизнь вечную». После отказа хозяин подверг рабов пытке голодом, и все они, кроме Евстратия, который имел богатый опыт постничества, умерли.
Иное толкование эпизода дано к. ист. н. А. В. Лаушкиным, основывавшимся на таком АИ, как тексте «Киево-Печерского Патерика». По-видимому, уже в рассматриваемый период на Руси были известны правила, запрещающие не только есть вместе с иноверцами, но и брать (покупать) приготовленную ими пищу (…) В слове «О блаженном Еустратии постници» рассказывается о том, как захваченные половцами пленники были проданы некоему иудею, у которого в течение нескольких дней «изомроша от глада и истаавша жаждею». В живых остался только закаленный постом монах Евстратий. Увидев произошедшее, иудей обвинил в «погыбели злата его» (денег, уплаченных за пленников) Евстратия. Обвинение, как следует из контекста, было вызвано тем, что монах, призывавший единоверцев стоять за Христа до конца, настроил их ничего не есть и не пить из предлагаемой иудеями пищи.
Тогда хозяин распял Евстратия на кресте в день иудейской пасхи, а затем убил, проткнув копьём. Тело Евстратия бросили в море, откуда оно было извлечено и похоронено в Ближних пещерах Киево-Печерской лавры, где мощи святого лежат и в настоящее время. Частицы его мощей хранятся в храме преподобномученика Евстратия Печерского в Терновке (Крым).
Смерть Евстратия, по-видимому, известного в городе человека, а также большого числа других людей, всколыхнула население. Негодование жителей Херсонеса привело к убийству епарха и еврея-рабовладельца, а возможно явилось причиной еврейского погрома.
Память Евстратия Печерского совершается 28 марта (10 апреля по н. ст.).
Постником и мучеником явился еси похвала, преподобне Евстратие, прежде бо воздержанием плоть умертвив, последовал еси Христу, нося крест свой. Последи же и сам на крест вознесен быв и копием в ребра прободен, в руце Божии душу предал еси. Колесницею огненною возносим на Небеса, сугубо венчался еси от Христа Бога и Спаса душ наших.
Яко ревнитель страсти Владычней и постников усердный последователь сый, пленники учением твоим наставль, Христови привел еси, Евстратие, и нас, пленных страстьми, мольбами своими свободи и подражатели честному твоему житию покажи, зовущих: радуйся, испивый сладостне чащу Христовых страданий.
Почитание Евстратия в точности совпадает по содержанию и по времени возникновения с почитанием англичанами св. Уильяма Норичского (). В связи с подобными обвинениями иудеев в ритуальных убийствах, в этот период в Европе распространялось поверье, будто иудеи на «свою» Пасху убивают христиан (обычно, младенцев) и используют их кровь для приготовления пасхальных опресноков — мацы (см. Кровавый навет на евреев).
Подробное описание жития отца Евстратия, связанное с событиями, происходившими в Киеве и в Печерском монастыре в 1096 году и зафиксированными в «Повести временных лет» Нестора Летописца и Густинской летописи, имеются в Киево-Печерском патерике.
В последние десятилетия были сделаны неоднократные попытки склонить церковь к деканонизации Евстратия в связи с явной антииудейской позицией его жития и повествования о нём в целом. Попытки эти предпринимались как представителями еврейских общин и еврейскими религиозными деятелями, так и самими христианами. Александр Мень резко выступал за деканонизацию святого, о чём написано во многих его статьях. В интервью, данном журналу «Евреи в СССР», Александр Мень высказался за деканонизацию русских православных святых преп. Евстратия Печерского и муч. Гавриила Белостокского, а также за пересмотр православных богослужебных текстов с целью изъятия из них «выпадов» против евреев.
В 1965 году Второй Ватиканский собор Католической Церкви отменил почитание Симона Трентского (также известного как пример кровавого навета) как основанный на злонамеренной мистификации, и удалил имя Симона Трентского из католической мартирологии. Так же ранее поступила англиканская церковь с почитанием Хью Линкольнского.