Родился в семье учителя; окончил Московский университет (1868), занимался диалектологической работой в Литве, стажировался в Германии (у Курциуса и Лескина) и Франции (у Бреаля). Магистерская диссертация (1875) посвящена анализу ведийского языка. С 1876 по 1902 — профессор по кафедре сравнительной грамматики индоевропейских языков Московского университета, активно преподаёт, читает курсы индоевропеистики и общего языкознания. Почётный доктор (1884), член-корреспондент (1898), действительный член (1902) Российской академии наук; член ряда зарубежных академий и научных обществ. С 1902, в связи с избранием академиком, работает в Санкт-Петербурге, занимаясь исследовательской и издательской деятельностью.
В наследии Фортунатова выделяются две части: индоевропейские исследования и исследования по общей теории грамматики; в обе эти области он внёс существенный для своего времени вклад.
Как индоевропеист Фортунатов был последователем приверженцев методологии и концепции младограмматиков, у виднейших представителей которых он учился в Германии; он может считаться первым крупным российским младограмматиком. Наиболее известны исследования Фортунатова в области индоарийской и балтославянской исторической фонетики, и в особенности балтославянской исторической акцентологии, которую он начал изучать один из первых. Его именем названы два звуковых закона: «закон Фортунатова», описывающий условия возникновения древнеиндийских ретрофлексных звуков, и известный «закон Фортунатова-де Соссюра» (независимо сформулированный также Ф. де Соссюром), относящийся к балтославянской исторической акцентологии и описывающий эволюцию одного из типов ударения в балтийских и славянских языках.
В ряде работ (но в основном в лекциях «московского» периода его деятельности) Фортунатовым были высказаны оригинальные теоретические взгляды по общей морфологии. Они касаются прежде всего таких понятий, как грамматическая форма, словоизменение, словообразование и формообразование, а также классификации частей речи. Фортунатов обратил внимание на различие грамматических и неграмматических значений и на особый характер выражения этих значений в языках флективного типа; к Фортунатову восходит также популярное в отечественной грамматической традиции противопоставление «словоизменения» и «формообразования», а также «синтаксических» и «несинтаксических» грамматических категорий (использовавшееся позднее в той или иной степени в исследованиях П. С. Кузнецова, Р. И. Аванесова, А. И. Смирницкого и др.). Он особенно подчёркивал роль морфологических (или «формальных» — откуда называние его школы) коррелятов языковых значений и, в частности, предложил нетрадиционную классификацию частей речи, основанную практически только на морфологических критериях.
При анализе взглядов Фортунатова следует учесть, что они не были сформулированы им в целостном виде и во многом реконструируются на основе анализа отдельных примеров и текстов лекций; не все работы Фортунатова опубликованы даже в настоящее время. С другой стороны, идеи Фортунатова, высказанные им на протяжении 25 лет преподавания, оказали значительное влияние на последующее поколение российский лингвистов и во многом подготовили почву для появления российского структурализма в лице Н. С. Трубецкого и Р. О. Якобсона (последний, в частности, особенно ценил Фортунатова и много сделал для его памяти). Непосредственными учениками Фортунатова являются А. А. Шахматов, В. К. Поржезинский, Д. Н. Ушаков, Н. Н. Дурново и др. И как историк языка, и как теоретик Фортунатов всю жизнь оставался приверженцем «строгих» методов; его своеобразный научный стиль, сочетавший глубину и точность с сухостью и некоторой тяжеловесностью изложения, также оказал большое влияние на последующие поколения лингвистов, в особенности тех, кто желал дистанцироваться от филологической традиции «виноградовской школы».