Родилась 12 мая 1820 во Флоренции. С 1837 по 1839 путешествовала с родителями по Европе. В 1849 посетила Институт диаконис в Кайзерверте (Германия) и возвратилась в Англию с твёрдым намерением стать сестрой милосердия. В 1853 стала управляющей небольшой частной больницей на Харли-Стрит в Лондоне.
В октябре 1854, в период Крымской кампании, Флоренс вместе с 38 помощницами, среди которых были монахини и сёстры милосердия, отправилась в полевые госпитали сначала в Скутари (Турция), а затем в Крым. Последовательно проводила в жизнь принципы санитарии и ухода за ранеными. В результате менее чем за шесть месяцев смертность в лазаретах снизилась с 42 до 2,2 %.
В 1856 году Флоренс на свои деньги поставила на высокой горе в Крыму над Балаклавой большой крест из белого мрамора в память о солдатах, врачах и медсёстрах, погибших в Крымской войне.
Крымская война сделала Флоренс национальной героиней. Вернувшиеся с фронта солдаты рассказывали о ней легенды, называя её «леди со светильником», потому что по ночам с лампой в руках она всегда, как добрый светлый ангел, сама обходила палаты с больными.
По возвращении в Англию в 1856 Найтингейл было поручено реорганизовать армейскую медицинскую службу. В 1857 правительство выделило средства на организацию комиссии по проведению в жизнь необходимых реформ. В 1859 военным министром вновь стал Херберт, с его помощью Найтингейл добилась того, чтобы больницы были оснащены системами вентиляции и канализации; больничный персонал в обязательном порядке проходил необходимую подготовку; в больницах велась строгая статистическая обработка всей информации. Была организована военно-медицинская школа, в армии велась разъяснительная работа о важности профилактики болезней.
Найтингейл была способным математиком, занималась статистическими исследованиями, стала новатором в использовании методов инфографики в статистике, в частности, применяла круговые (секторные) диаграммы. В 1859 году была избрана членом Королевского статистического общества и впоследствии стала почётным членом Американской статистической ассоциации.
Она написала ряд книг — «Заметки о факторах, влияющих на здоровье, эффективность и управление госпиталями британской армии» (Notes on Matters Affecting the Health, Efficiency and Hospital Administration of the British Army, 1858) и «Как нужно ухаживать за больными» (Notes on Nursing: What It Is and What It Is Not, 1860).
Во время войны Найтингейл удалось собрать по подписке большую сумму денег, на которые в 1860 была организована первая в мире школа сестёр милосердия при больнице Святого Фомы в Лондоне. Вскоре выпускницы этой школы начали создавать аналогичные учреждения при других больницах.
Умерла Найтингейл в Лондоне 13 августа 1910.
В 1883 Найтингейл была награждена Королевским Красным крестом, а в 1907 — орденом «За заслуги».
В 1912 году Лига Международного Красного Креста и Красного полумесяца (с ноября 1991 называется Международной Федерацией Обществ Красного Креста и Красного Полумесяца) учредила медаль имени Флоренс Найтингейл до сих пор самую почётную и высшую награду для сестёр милосердия во всём мире.
12 мая в день рождения Флоренс Найтингейл, мир отмечает Международный день медицинской сестры.
Синдром (англ. Florence Nightingale effect), проявляющийся когда врач или медсестра, ухаживающие за больным, начинают испытывать к нему чувства, которые могут перерасти в любовь.