Гертруда Элайон родилась 23 января 1918 года в Нью-Йорке в еврейской иммигрантской семье (её отец иммигрировал в 12 лет из Литвы, мать в 14 лет — из России). Окончила Хантеровский колледж, получив бакалавриат в 1937 году, и Нью-Йоркский университет по специальности химия в 1941 году. После этого работала лаборантом и учителем, пока не стала ассистентом у Джорджа Хитчингса в фармацевтической компании Бороу-Веллкам (сейчас GlaxoSmithKline). Элайон как женщина не смогла поступить в аспирантуру и никогда формально не защищала диссертацию на степень доктора философии, хотя позже и получила почётную степень доктора философии от Университета Джорджа Вашингтона.
Среди лекарственных препаратов, найденных Элайон, меркаптопуринол (антилейкемический препарат), иммуносупрессор азатиоприн, аллопуринол (применяемый при подагре), антималярийный препарат пириметамин, триметоприм, ацикловир (антивирусный препарат, применяемый для лечения герпеса).