Прежде всего известен как портретист, создавший более тысячи портретов своих современников, включая шесть первых президентов США.
Гилберт Стюарт был третьим ребёнком в семье. Отец, также Гилберт Стюарт, иммигрант из Шотландии, работал на мельнице по изготовлению нюхательного табака, а мать, Элизабет Энтони Стюарт, происходила из семьи землевладельцев из Род-Айленда. В возрасте семи лет будущий художник вместе с семьёй переехал в Ньюпорт. С раннего возраста он проявил склонности к живописи, учился у шотландского художника Космо Александера, и в 1771 году в возрасте 14 лет вместе с ним отправился в Эдинбург, чтобы закончить художественное образование. Однако Александер умер на следующий год, и после короткой безуспешной попытки зарабатывать себе на жизнь живописью Стюарт вернулся в Ньюпорт.
Так как перспективы образования в Америке представлялись неблагоприятными из-за войны, а семья Стюарта эмигрировала в Новую Шотландию, в 1775 году он снова отправился в Англию. В скором времени он начал учиться у Бенджамина Уэста, и уже в 1777 году выставлялся в Королевской Академии художеств. В дальнейшем его карьера развивалась очень успешно, не в последнюю очередь благодаря успеху картины «Конькобежец», и в какой-то момент цены на картины Стюарта превысили цены на полотна самых известных английских художников, включая Томаса Гейнсборо и Джошуа Рейнольдса. Тем не менее, Стюарт был крайне беспечен в отношении денег, и однажды чуть было не был отправлен в долговую тюрьму. В 1787 году он бежал в Дублин, а в 1793 году вернулся в США, поселившись в Нью-Йорке.
В 1795 году он переехал в пригород Филадельфии, где открыл мастерскую. Там он не только мог заниматься живописью, но и имел возможность познакомиться с многими знаменитостями. Так, Стюарт выполнил несколько портретов Джорджа Вашингтона, в том числе самый знаменитый, неоконченный «The Athenaeum». Позже этот портрет был использован для создания портрета Вашингтона на долларовой купюре. При жизни Стюарт снял с него 130 копий.
В 1803 году Стюарт открыл ателье в Вашингтоне, а в 1805 году в связи с финансовыми трудностями переехал в Бостон. В 1824 году он перенёс удар, оставивший его до конца жизни частично парализованным. Тем не менее, он продолжал писать картины и в последние два года жизни.
Стюарт умер в Бостоне в возрасте 72 лет. Из-за долгов его жена и дочери не смогли купить ему место на кладбище, и Стюарт был похоронен в Бостон Коммон в общей могиле. Через десять лет семья оправилась от финансовых потрясений и планировала перенести останки художника в Ньюпорт, но не смогла идентифицировать их.
В настоящее время Гилберт Стюарт является общепризнанной основополагающей фигурой американской живописи. Его картины находятся в коллекциях самых престижных музеев США. Дом, где он родился, сохранился и в 1930 году был превращён в музей.