Нахтигаль родился в семье лютеранского пастора. Получил медицинское образование в университетах Галле, Вюрцбурга и Грейфсвальда, служил военным хирургом. Из-за легочного туберкулёза переехал в Северную Африку (Алжир, Тунис), участвовал в качестве хирурга в нескольких экспедициях в центральные районы Африки.
В 1869 году прусский король Вильгельм I назначил Нахтигаля эмиссаром, поручив ему передать дары Умару, правителю государства Канем-Борно (территория современной Нигерии и Чада). Экспедиция отправилась в 1869 году из Триполи и через два года прибыла к месту назначения. Экспедиция завершилась зимой 1874 года прибытием в Хартум, в ноябре 1875 году Нахтигаль приехал в Каир. За время путешествия были исследованы нагорье Тибести, область Борку, районы центральной Сахары и озера Чад, правый берег реки Шари на территории султаната Багирми, нагорье Вадаи и плато Кордофан. Свои наблюдения Нахтигаль описал в сочинении «Сахара и Судан» (3 тт., 1879—1889).
При возвращении Нахтигаль ещё раз был в Камеруне и умер от осложненного легочным кровотечением туберкулёза 20 апреля 1885 года на борту канонерки «Чайка», находившейся в океане недалеко от мыса Кейп-Пальмас (Либерия), был захоронен в Гран-Басамe (ныне в Республике Кот-д’Ивуар), в 1888 году прах был перезахоронен в Дуала (Камерун) и на могиле воздвигнут памятник.