Гвидо Мазетти начал карьеру в клубе «Верона», первоначально играя «полузащитника», а лишь затем вратаря. В 1930 году он преешёл в клуб «Рома», в которой дебютировал 28 сентября в матче с «Моденой», которая завершилась со счётом 1:1. Мазетти провёл за «Рому» 13 лет, проведя в её составе 339 матчей, он был капитаном команды. Последний матч Мазетти провёл 18 февраля 1943 года.
Гвидо был игроком сборной Италии, но провёл за неё лишь 2 игры, он участвовал в двух чемпионатах мира, но оба турнира просидел на скамье запасных.
После окончания игровой карьеры, Мазетти стал тренером, начав работу с клубом «Губбио», затем работал в «Роме» и «Палермо».