Окончив среднюю школу в Грайфсвальде, Бильрот поступил в Грайфсвальдский университет. Впоследствии он обучался в Гёттингенском университете, а степень доктора медицины получил в Берлинском университете.
В 1853-60 годах Бильрот работал хирургом в клинике Шарите под руководством знаменитого хирурга Бернгардта фон Лангенбека. В 1860-67 годах он был профессором Цюрихского университета, а также руководил хирургической клиникой. В это время Бильрот опубликовал свой ставший классическим учебник «Die allgemeine chirurgische Pathologie und Therapie» («Общая хирургическая патология и терапия», 1863). В это же время он ввёл систему медицинской отчётности, которая предполагала публикацию всех результатов, как плохих, так и хороших, что давало возможность более объективно оценивать заболеваемость и летальность, а также более полноценно сравнивать эффективность различных методов лечения. В 1867 году он был назначен профессором хирургии в Венском университете; в то же время он работал хирургом во второй хирургической клинике Венского госпиталя (Allgemeine Krankenhaus). Огромная заслуга Бильрота в том, что он активно внедрял чистоту в медицинскую практику: в своем отделении он требовал производить ежедневную уборку, операционные столы стали мыть после каждой операции. Помимо этого он ввёл обязательное ношение ежедневно сменяемых белых кителей для врачей — тем самым традиция ношения грязных сюртуков как доказательство опытности хирурга была пресечена. Все эти меры в значительной степени уменьшили послеоперационную смертность.
С именем Бильрота связан ряд важных достижений хирургии, в частности: первая эзофагэктомия (1871), первая ларингэктомия (1873) и, что особо значимо, первая успешная гастрэктомия (1881) по поводу рака желудка. Бильрот также внёс значительный вклад в модернизацию хирургического образования. Среди его учеников было много выдающихся хирургов (таких как Кохер, Черни, Гуссенбауэр, Винивартер, Микулич, Вельфлер и др.).
Бильрот был талантливым пианистом и скрипачом. Его связывали тесные отношения с Иоганном Брамсом: известно, например, что Брамс часто посылал Бильроту для ознакомления рукописи своих произведений до их публикации; Бильроту посвящены первые два струнных квартета Брамса.
Бильрот является автором сочинения «Wer ist musikalisch?» («Кто такой музыкально одарённый человек?»), которое представляет собой одну из первых попыток подойти к проблеме музыкальной одарённости с научной точки зрения.