И.Трнка изучал живопись у Ярослава Бенды, затем работал в пльзенском кукольном театре Я.Скупы. Первое время он презентовал себя как сценический художник; кроме этого выступал как скульптор и график. Всё же эти его работы среди искусствоведов менее известны, нежели созданные И.Трнкой кукольные мультипликацтонные фильмы и книжние иллюстрации. В начале 1940-х годов художник начинает своё сотрудничество с Адольфом Забранским в иллюстрировании детской литературы. Во время Второй мировой войны Трнка уезжает в Прагу, где работает художником сцены и художником по костюмам. Он основывает также киностудию Ji?? Trnka a Brat?i v triku (Иржи Трнка и Братья в мультипликации). При помощи этой фирмы, где он создал свои кукольные и рисованные фильмы, И.Трнка завоевал международное признание. В последние годы жизни Трнка много работал для открытия Международной выставки Экспо-67 в Монреале, а также вновь обратился к скульптуре и иллюстрированию книг.
Иржи Трнка считается основателем чешской и чехословацкой мультипликации. Многие исследователи и историки кино признают его крупнейшим в мире специалистом в области кукольного фильма. Собранный и наработанный им художественный и режиссёрский опыт, оригинальность решений и многоплановость образов придали чехословацкой мультипликации ни с чем иным не сравнимый стиль и международно признанный высокий уровень создаваемого киноматериала. И.Трнка работал преимущественно с куклами. К одним из наиболее известных его фильмам относятся Star? pov?sti ?esk? (Старочешские предания по Алоису Йирасеку, Osudy dobr?ho voj?ka ?vejka (Бравый солдат Швейк) по Ярославу Гашеку и Сон в летнюю ночь по У.Шекспиру.
Из других мультипликаций мастера следует отметить вышедший на экраны в 1960-е годы фильм Kybernetick? babi?ka (Кибербабушка), посвящённый проблемам искусственного интеллекта; вестерн Песня прерии; детские фильмы Шпаличек и Принц Баяя. Многие мультфильмы И.Трнки были удостоены международных и национальных премий. Сам художник в 1968 году получил премию Ганса-Христиана Андерсена за свои иллюстрации книг.
В 1963 году И.Трнке было присвоено звание Народный артист Чехословакии.