Биография Бабеля, известная во многих подробностях, всё же имеет некие пробелы, связанные с тем, что автобиографические заметки, оставленные самим писателем, во многом являются приукрашенными, изменёнными, или даже «чистым вымыслом» с определённой целью, соответствовавшей политическому моменту того времени. Тем не менее, устоявшаяся версия биографии писателя такова:
Родился в Одессе на Молдаванке в еврейской семье бедного торговца Маня Ицковича Бобеля (Эммануила (Мануса, Мане) Исааковича Бабела), родом из Белой Церкви, и Фейги (Фани) Ароновны Бобель. Семья жила в доме на углу Дальницкой и Балковской улиц. Начало века было временем общественных беспорядков и массового исхода евреев из Российской империи. Сам Бабель выжил во время погрома 1905 года (его спрятала христианская семья), а его дед Шойл стал одним из трёхсот убитых тогда евреев.
Чтобы поступить в подготовительный класс одесского коммерческого училища Николая I, Бабель должен был превысить квоту на студентов-евреев (10 % в черте оседлости, 5 % за её пределами и 3 % для обеих столиц), но несмотря на положительные отметки, дававшие право на обучение, место было отдано другому юноше, чьи родители дали взятку руководству училища. За год образования на дому Бабель прошёл программу двух классов. Помимо традиционных дисциплин, он изучал Талмуд и занимался музыкой. Игре на скрипке его учил известный педагог Петр Столярский, основатель известной школы. Исаак занимался в доме на Тираспольской улице, 21, где одно время жила семья Бабелей.
После ещё одной неудачной попытки поступить в Одесский университет (вновь из-за квот) он оказался в Киевском институте финансов и предпринимательства, который закончил под своей первоначальной фамилией Бобель. Там он встретил свою будущую жену Евгению Гронфейн, дочь богатого киевского промышленника, которая бежала с ним в Одессу.
Свободно владея идишем, русским и французским языками, Бабель первые свои произведения писал на французском языке, но они до нас не дошли. Затем он отправился в Петербург, не имея на это, по собственным воспоминаниям, права, так как город находился вне черты осёдлости. (Недавно обнаружен документ, выданный петроградской полицией в 1916 году, который разрешал Бабелю проживать в городе на время учёбы в Психоневрологическом институте, что подтверждает неточность писателя в его романтизированной автобиографии). В столице ему удалось поступить сразу на четвёртый курс юридического факультета Петроградского психоневрологического института.
Первые рассказы на русском Бабель опубликовал в журнале «Летопись» в 1916. «Элья Исаакович и Маргарита Прокофьевна» и «Мама, Римма и Алла» привлекли внимание, и Бабеля собрались судить за порнографию (1001-я статья), чему помешала революция. По совету М. Горького, Бабель «ушёл в люди» и переменил несколько профессий.
Осенью 1917 года Бабель, отслужив несколько месяцев рядовым, дезертировал и пробрался в Петроград, где в декабре 1917 года пошёл работать в ЧК, а затем работал в Наркомпрос и в продовольственных экспедициях. Печатался в газете «Новая жизнь». Весной 1920 г. по рекомендации М. Кольцова под именем Кирилла Васильевича Лютова был направлен в 1-ю Конную армию в качестве военного корреспондента Юг-РОСТа, был там бойцом и политработником. С нею он воевал на румынском, северном и польском фронтах. Потом работал в Одесском губкоме, был выпускающим редактором 7-ой советской типографии (ул. Пушкинская, 18), репортёром в Тифлисе и Одессе, в Госиздате Украины. Согласно озвученному им самим мифу в автобиографии, в эти годы не писал, хотя именно тогда начал создавать цикл «Одесских рассказов».
В 1920 году Бабель был назначен в 1-ю Конную армию, под командованием Семёна Будённого и стал участником Советско-польской войны 1920 года. Всю кампанию Бабель вёл дневник («Конармейский дневник» 1920 год), который послужил основой для сборника рассказов «Конармия», в котором насилие и жестокость красноармейцев сильно контрастирует с интеллигентностью автора-повествователя Кирилла Лютова. Печатался в газете Политотдела 1-й Конармии «Красный кавалерист».
Несколько рассказов, которые позже вошли в сборник «Конармия», были опубликованы в журнале Владимира Маяковского «Леф» в 1924 году. Описания жестокости войны были далеки от революционной пропаганды того времени. У Бабеля появляются недоброжелатели, так Семён Будённый был в ярости от того, как Бабель описал жизнь и быт красноармейцев и в статье «Бабизм Бабеля» назвал его «дегенератом от литературы». Но Бабель находился под покровительством Максима Горького, что гарантировало публикацию книги, которую, впоследствии, перевели на многие языки мира. Климент Ворошилов в 1924 г. жаловался Дмитрию Мануильскому, члену ЦК, а позже главе Коминтерна, что стиль произведения о Конармии был «неприемлемым». Сталин же считал, что Бабель писал о «вещах, которые не понимал». Горький же высказал мнение, что писатель, наоборот, «украсил изнутри» казаков «лучше, правдивее, чем Гоголь запорожцев». Дискуссия продолжалась до 1928 года.
В молодости Хорхе Луис Борхес писал про «Конармию»:
В 1924 году в журналах «Леф» и «Красная новь» опубликовал ряд рассказов, позднее составивших циклы «Конармия» и «Одесские рассказы». Бабель сумел мастерски передать на русском языке стилистику литературы, созданной на идише (особенно это заметно в «Одесских рассказах», где местами прямая речь его героев является подстрочным переводом с идиша).
Советская критика тех лет, отдавая должное таланту и значению творчества Бабеля, указывала на «антипатию делу рабочего класса» и упрекала его в «натурализме и апологии стихийного начала и романтизации бандитизма».
В «Одесских рассказах» Бабель в романтическом ключе рисует жизнь еврейских уголовников начала XX века, находя в обиходе воров, налётчиков, а также мастеровых и мелких торговцев экзотические черты и сильные характеры. Самым запоминающимся героем этих рассказов является еврей-налётчик Беня Крик (его прототип — легендарный Мишка Япончик), по выражению «Еврейской энциклопедии» — воплощение бабелевской мечты о еврее, умеющем постоять за себя. С 1924 года Бабель жил, главным образом, в Москве.
В 1926 году выступил редактором первого советского собрания сочинений Шолом-Алейхема, в следующем году адаптировал для кинопостановки роман Шолом-Алейхема «Блуждающие звёзды».
В 1927 году принял участие в коллективном романе «Большие пожары», публиковавшемся в журнале «Огонёк».
В последующий период, с ужесточением цензуры и наступлением эпохи большого террора Бабель печатался всё меньше. Занимался переводами с языка идиш. Несмотря на свои сомнения относительно происходящего, не эмигрировал, хотя имел такую возможность, С сентября 1927 по октябрь 1928, с сентября 1932 по август 1933 жил за границей (Франция, Бельгия, Италия). В 1935 году — последняя поездка за границу на антифашистский конгресс писателей. Жена Бабеля проживала во Франции, там же родилась и жила его дочь. Его мать и сестра Мария жили в Бельгии.
Делегат I съезда писателей СССР (1934).
15 мая 1939 Бабель был арестован на даче в Переделкино по обвинению в «антисоветской заговорщической террористической деятельности» и шпионаже (дело № 419). При аресте у него изъяли несколько рукописей, которые оказались навсегда утраченными (15 папок, 11 записных книжек, 7 блокнотов с записями). Судьба его романа о ЧК остается неизвестной. В 1939 году Арам Ванециан начал писать портрет Бабеля, оказавшийся последним прижизненным портретом писателя.
На допросах Бабеля подвергали жестоким пыткам. Военной коллегией Верховного Суда СССР он был приговорён к высшей мере наказания и расстрелян на следующий день, 27 января 1940.. Расстрельный список был подписан Секретарём ЦК ВКП(б) И. В. Сталиным. В числе возможных причин неприязни Сталина к Бабелю называют то, что он был близким другом Я. Охотникова, И. Якира, Б. Калмыкова, Д. Шмидта, Е. Ежовой и других «врагов народа».
В 1954 году посмертно реабилитирован. При активном содействии Константина Паустовского, любившего Бабеля и оставившего о нём тёплые воспоминания, после 1956 года Бабель был возвращён в советскую литературу. В 1957 году был издан сборник «Избранное» с предисловием Ильи Эренбурга, который назвал Исаака Бабеля одним из выдающихся писателей XX века, блестящим стилистом и мастером новеллы.
Евгения Борисовна Гронфейн, с которой он сочетался законным браком, в 1925 году эмигрировала во Францию. Его другая (гражданская) жена, с которой он вступил в отношения после расставания с Евгенией — Тамара Владимировна Каширина (Татьяна Иванова), их сын, названный Эммануилом (1926), позже стал известен в хрущёвское время как художник Михаил Иванов (член «Группы девяти»), и воспитывался в семье отчима — Всеволода Иванова, считая себя его сыном. После расставания с Кашириной Бабель, выезжавший за границу, на некоторое время воссоединился с законной супругой, которая родила ему дочь Наталью (1929), в замужестве — американский литературовед Натали Браун (под чьей редакцией было издано на английском языке полное собрание сочинений Исаака Бабеля).
Последняя (гражданская) жена Бабеля — Антонина Николаевна Пирожкова, родила ему дочь Лидию (1937), с 1996 года проживала в США. В 2010 году в возрасте 101 года приезжала в Одессу и смотрела макет памятника мужа. Скончалась в сентябре 2010 года.
Творчество Бабеля оказало огромное влияние на литераторов так называемой «южнорусской школы» (Ильф, Петров, Олеша, Катаев, Паустовский, Светлов, Багрицкий) и получило широкое признание в Советском Союзе, его книги переведены на многие иностранные языки.
Наследие репрессированного Бабеля в чём-то разделило его судьбу. Его начали снова печатать лишь после «посмертной реабилитации» в 1960-х годах, тем не менее, его произведения подвергались сильной цензуре. Дочь писателя, американская гражданка Натали Бабель (Браун, англ. Natalie Babel Brown, 1929—2005) сумела собрать малодоступные или неопубликованные произведения и издать их с комментариями («The Complete Works of Isaac Babel», 2002).