Исидор Анненский родился 13 марта 1906 года в Ольвиополе. После окончания театральной школы в Одессе работал актёром и режиссером в театрах Архангельска, Ростова-на-Дону, Баку, в Московском театре Революции.
Окончив в 1934 году режиссёрский факультет ГИТИСа, а затем Киноакадемию при ГИКе (курс Сергея Эйзенштейна), самостоятельно поставил фильм «Медведь». Уже этот дипломный фильм принес ему всесоюзную славу.
Впоследствии Анненский неоднократно обращался к экранизациям произведений Чехова и каждая картина становилась событием отечественного кинематографа — «Человек в футляре», «Свадьба», «Анна на шее», много работал в области экранизации русской литературной классики — «Княжна Мери» (по Лермонтову) и др., снимал ленты на современную тему — «Екатерина Воронина» и др.
В его картинах снимались крупнейшие актёры своего времени —Ольга Андровская, Михаил Жаров, Фаина Раневская, Алексей Грибов, Николай Хмелёв, Александр Вертинский и многие другие. У него дебютировали в кинематографе актёры Ольга Андровская, Людмила Хитяева, Юрий Соломин, Ирина Мирошниченко и другие.
Исидор Анненский является автором сценариев почти всех поставленных им картин.
Ленты сценариста и кинорежиссёра Исидора Анненского навсегда вошли в золотой фонд советского российского кино, о его творчестве рассказывается во всех энциклопедических изданиях по кинематографу, материалы о нём хранятся в Музее Кино в Москве.
Им написана автобиографическая книга «В театре и кино» (Москва; изд. БПСК,1974 г.) (экземпляр хранится в Государственной Российской библиотеке (бывш. Ленинской) в Москве. Прочитан курс лекций на Высших курсах сценаристов и режиссеров.
За заслуги в области киноискусства ему было присвоено звание Заслуженного деятеля искусств России.(1971 г.).